分子標(biāo)記技術(shù)在紅曲菌菌種鑒別中的應(yīng)用.pdf

1、紅曲菌(Monascus spp．)是我國重要的微生物資源，在我國已有上千年的使用歷史，被廣泛用于食品發(fā)酵劑、食品著色劑和中藥配伍的生產(chǎn)。由于紅曲菌在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生多種具有生理活性的代謝產(chǎn)物：如紅曲色素、Monacolin類物質(zhì)、γ-氨基丁酸以及多種酶類，近年來，國內(nèi)外關(guān)于紅曲菌及其代謝產(chǎn)物的研究成為熱點(diǎn)。但是，關(guān)于紅曲菌的分類，特別是屬以下種的分類鑒定仍然存在許多爭議和混亂，這對于紅曲菌的研究和應(yīng)用是不利的。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展

2、，分子標(biāo)記技術(shù)作為傳統(tǒng)分類鑒定方法的補(bǔ)充正逐步引入紅曲菌菌種鑒別和親緣關(guān)系研究中。 本研究以67株紅曲菌為材料，從形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等方面探索了紅曲菌菌種的鑒別方法，以期為紅曲菌菌種鑒別和親緣關(guān)系研究提供借鑒。主要研究結(jié)果如下： 1．從全國各地采集了24份樣品，經(jīng)分離純化，獲得53株紅曲菌株；索要和購買得到14株紅曲菌菌株作為參考菌株，共67株菌株。根據(jù)李鐘慶等人的分類方法，通過觀察菌落形態(tài)和顯微特征，初步鑒定

3、這些菌株中有39株安卡紅曲菌(M.anka)、9株紫色紅曲菌(M. purpureus)、7株叢毛紅曲菌(M. pilosus)、4株巴克紅曲菌(M. barkeri)，另外，還有橙色紅曲菌(M. aurantiacus)、發(fā)白紅曲菌(M. albidus)、煙灰色紅曲菌(M.fulinosus)、紅色紅曲菌(M. ruber)、新月紅曲菌(M. lunisporas)和阿根廷紅曲菌(M. argentinens&)各1株，共10個(gè)種。

4、另有2株(M-3和M-26)歸屬關(guān)系待定。 2．在形態(tài)學(xué)鑒定基礎(chǔ)上，從上述67株菌株中選出51株(14株參考菌株和37株分離菌株)代表性菌株進(jìn)行了酯酶同工酶分析。結(jié)果表明，不同種間的酯酶同工酶電泳帶型具有多樣性，種內(nèi)菌株間帶型基本一致，與形態(tài)鑒定結(jié)果基本吻合。聚類分析結(jié)果顯示，在相似水平為70％處，51個(gè)菌株分為4個(gè)群：橙色紅曲菌、發(fā)白紅曲菌、煙色紅曲菌、巴克紅曲菌和叢毛紅曲菌為一群；紫色紅曲菌、安卡紅曲菌、紅色紅曲菌為一群；新

5、月紅曲菌和阿根廷紅曲菌各代表一群。 3．從14條ISSR引物中篩選出7條引物(808<'＃>、810<'＃>、811<'＃>、834<'＃>、835<'＃>、841<'＃>、842<'＃>)對上述51株紅曲菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增。7條引物共擴(kuò)增出108條帶，其中97.2％ 呈多態(tài)性，相似系數(shù)范圍為0.48～1.00。在相似水平為70％處，51個(gè)菌株分為4個(gè)群：發(fā)白紅曲菌、煙色紅曲菌、巴克紅曲菌和叢毛紅曲菌為一群；橙色紅曲菌、紫

6、色紅曲菌、安卡紅曲菌、紅色紅曲菌為一群；新月紅曲菌和阿根廷紅曲菌各為一群。 4．從30對SRAP引物中篩選出8對引物(me1-em2、me1-em4、me1-em5、me2．em4、me3-em2、me3-em6、me4-em4、me5-em6)對51株紅曲菌進(jìn)行擴(kuò)增。8對引物共擴(kuò)增出183條帶，其中94.5％呈多態(tài)性，相似系數(shù)范圍為0.46～1.00。聚類分析結(jié)果與ISSR．分析結(jié)果類似，在相似水平為70％處，51個(gè)菌株分為4

7、個(gè)群：發(fā)白紅曲菌、煙色紅曲菌、巴克紅曲菌和叢毛紅曲菌為一群；橙色紅曲菌、紫色紅曲菌、安卡紅曲菌、紅色紅曲菌為一群；新月紅曲菌和阿根廷紅曲菌各為一群。 5．對51個(gè)菌株進(jìn)行IGS擴(kuò)增。結(jié)果顯示，所有供試菌株均未能擴(kuò)增出IGS2片段，但均擴(kuò)增出清晰穩(wěn)定的IGS1片段，并且具有很好的多態(tài)性，相似系數(shù)范圍為0.42～1.00。聚類分析結(jié)果顯示，在相似水平為70％處，51個(gè)菌株分為3個(gè)群：紫色紅曲菌OUT2011、OUT2014和分離菌株