ISSR標(biāo)記技術(shù)在植物物證鑒定中應(yīng)用的初步研究.pdf

1、植物廣泛存在于自然界，與人們生活密切相關(guān)。在一些刑事案件中，檢驗(yàn)案犯無(wú)意間帶走或留在現(xiàn)場(chǎng)的植物葉片、果實(shí)、斑汁、花粉等植物物證，對(duì)確定嫌疑人與犯罪現(xiàn)場(chǎng)的關(guān)系，認(rèn)定或排除嫌疑人常起到關(guān)鍵作用。在實(shí)際案件中，嫌疑人或受害人身上或尸體上附著的植物樣品條件很差，憑借傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)的方法可能無(wú)法確認(rèn)、區(qū)分。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，可以應(yīng)用DNA技術(shù)對(duì)這些樣品進(jìn)行分析、檢驗(yàn)，確定它們的種類與周圍環(huán)境的相似性。 簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間(in

2、ter—simple sequence repeat，ISSR)分子標(biāo)記是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種DNA多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)。其基本原理是在簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequence repeat，SSR)的3'或5'端錨定1～4個(gè)核苷酸，然后對(duì)反向排列SSR間的一段DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)其長(zhǎng)度多態(tài)性。SSR也稱微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個(gè)(多為1～5個(gè))堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其中最常見的是二核苷酸重復(fù)，即(CA)n

3、和(TG)n。SSR在真核生物中的分布是非常普遍的，并且進(jìn)化變異速度非常快，因而錨定引物的ISSR-PCR可以檢測(cè)基因組許多位點(diǎn)的差異。與SSR-PCR相比，用于ISSR-PCR的引物不需要預(yù)先的DNA測(cè)序。ISSR分子標(biāo)記通常為顯性標(biāo)記，呈孟德爾式遺傳，具有簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定、DNA多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)。 目的：本研究采用植物分子生物學(xué)領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用價(jià)值的ISSR標(biāo)記技術(shù)，旨在建立一種在DNA分子水平對(duì)植物物證進(jìn)行種屬鑒定的方法，通

4、過(guò)篩選ISSR通用引物，對(duì)植物種和品種進(jìn)行鑒定，從而解決相關(guān)法律問(wèn)題。 方法：采用傳統(tǒng)CTAB法結(jié)合PVP、β—巰基乙醇和RNase A用于提取植物DNA，參考UBC(University of British Columbia)公布和文獻(xiàn)中報(bào)道的引物，篩選出擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高的通用引物，應(yīng)用PCR技術(shù)和聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合銀染顯譜的方法，對(duì)生活中常見的7類植物(蔥、玉米、辣椒、大豆、茄子、水稻和槐樹)和沈農(nóng)26

5、5、遼粳294、遼星1、R9311和日本晴共5種水稻進(jìn)行分型。對(duì)不同種屬、同一種屬不同品系和同一植株不同部位的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行比較；同時(shí)對(duì)將室溫干燥、陽(yáng)光曝曬、潮濕環(huán)境和農(nóng)藥處理的檢材與未處理檢材的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行比較；以及確定滿足ISSR分析的最低植物葉片取材量。最后采用NTSYS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算Dice相似系數(shù)，對(duì)同一種屬不同品種間進(jìn)行UPGMA聚類分析。 結(jié)果：使用引物UBC824對(duì)7類植物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物主要分布

6、在300～3000bp之間，不同種類具有不同的譜帶，可以區(qū)分被檢7類植物。應(yīng)用引物UBC835對(duì)5種水稻品種擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度位于300bp～3000bp，共檢出了28條泳動(dòng)度不同的電泳譜帶，根據(jù)檢出的擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)目和/或片段長(zhǎng)度不同，可以區(qū)分水稻的5個(gè)不同品種。5份供試水稻的Dice相似系數(shù)為0.48～0.71，平均為0.60。本研究通過(guò)對(duì)不同大小植物葉片和不同含量模板DNA的ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜分析，能夠獲得可滿足ISSR分析的

7、最低需要植物葉片取材量和模板DNA量分別為0.1c㎡和390pg，遠(yuǎn)不如普通PCR—STR的靈敏度高。應(yīng)用引物UBC824對(duì)分別保存于不同環(huán)境中(室溫干燥、潮濕環(huán)境、陽(yáng)光曝曬和農(nóng)藥噴灑)的植物檢材和保存不同時(shí)間的植物檢材的ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳譜帶的分析結(jié)果表明，在相同環(huán)境條件下放置時(shí)間越長(zhǎng)，植物DNA模板改變?cè)矫黠@；在相同作用時(shí)間下，陽(yáng)光曝曬組可以得到更多的譜帶，潮濕環(huán)境組的條帶較少，而室溫放置組得到的條帶最少。噴灑農(nóng)藥一周內(nèi)各時(shí)段提取

8、檢材與未噴灑農(nóng)藥檢材擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳譜帶數(shù)目、泳動(dòng)位置及產(chǎn)物量均無(wú)明顯差異。 結(jié)論：1、采用傳統(tǒng)CTAB法結(jié)合PVP、β—巰基乙醇和RNase A提取植物DNA能夠滿足ISSR-PCR分析的最小檢材需要面積為O．1c㎡。2、應(yīng)用ISSR-PCR技術(shù)，根據(jù)引物UBC824的擴(kuò)增結(jié)果可區(qū)分蔥、玉米、辣椒、大豆、茄子、水稻和槐樹共7種植物；根據(jù)引物UBC835的擴(kuò)增結(jié)果可對(duì)沈農(nóng)265、遼粳294、遼星1、R9311和日本晴5種水稻檢材進(jìn)