ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在桑黃、黑木耳遺傳分析上的應(yīng)用研究.pdf

1、DNA分子標(biāo)記技術(shù)是基于DNA技術(shù)的分子標(biāo)記體系，可以反映生物個(gè)體或種群之間的差異性DNA片段，相對(duì)于傳統(tǒng)的形態(tài)標(biāo)記和生化標(biāo)記具有穩(wěn)定、精確、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)?；赟SR技術(shù)的ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是其中應(yīng)用最為廣泛的一種，已被廣泛應(yīng)用于食藥用菌的遺傳多樣性、菌株鑒別等方面的研究。
　　“桑黃”是中國(guó)一類傳統(tǒng)藥用真菌，具有抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等多種藥用價(jià)值。但該類群中，被認(rèn)為藥效最佳、真正“桑黃”的桑黃纖孔菌（Inonotus sa

2、nghaung）與其它類群的桑黃從子實(shí)體上區(qū)分較為困難，導(dǎo)致“桑黃”名稱混亂現(xiàn)象嚴(yán)重，制約了“桑黃”產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。中國(guó)黑木耳(Auricularia heimuer F.Wu，B.K.Cui&Y.C.Dai)人工栽培已有二千多年的歷史，同株異名、同名異株、菌種退化現(xiàn)象嚴(yán)重制約黑木耳生產(chǎn)的可持續(xù)性，優(yōu)良品種的選育迫在眉睫。開展桑黃栽培品種、黑木耳主要栽培品種及黑木耳孢子單核體的遺傳多樣性分析，掌握不同栽培菌株鑒別方法，對(duì)明確桑黃栽培菌株

3、的類群，充分保護(hù)桑黃、黑木耳種質(zhì)資源、開展黑木耳良種選育具有重大意義。
　　本研究收集5個(gè)桑黃栽培品種，1個(gè)桑黃野生品種，應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合ITS分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行菌株鑒定及遺傳分析;收集34個(gè)黑木耳栽培品種及5個(gè)黑木耳品種的共計(jì)100個(gè)孢子單核體，應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1、確定了適用于桑黃物種的ISSR分析最佳PCR條件:20μL體系中含有1U DNA聚合酶、0.5μm

4、ol/L引物，0.15mmol/L dNTPs、50ng DNA模板。比理論Tm值略高的退火溫度，35個(gè)循環(huán)。
　　2、篩選出了12條對(duì)桑黃基因組擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性較好的引物，共擴(kuò)增出194條帶。根據(jù)擴(kuò)增條帶計(jì)算遺傳相似性系數(shù)并構(gòu)建聚類圖，桑2、桑4、桑5聚在一起，桑1、桑3單獨(dú)聚在一起，表明桑2、桑4、桑5的遺傳相似性較高。從194條帶中選擇29個(gè)最佳條帶構(gòu)建5個(gè)桑黃栽培菌株的分子身份證。
　　3、對(duì)6個(gè)桑黃菌株的rDNA

5、ITS序列進(jìn)行分析，通過BLAST比對(duì)，得到最似物種名，桑1為Inonotus linteus，桑2、桑4、桑5為Inonotus vaninii，桑3為Inonotus obliquus，桑6為Inonotu sanghaung，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。ITS分子標(biāo)記結(jié)果與ISSR分子標(biāo)記結(jié)果一致，證明兩者相結(jié)合可對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
　　4、篩選出10條引物，對(duì)34個(gè)黑木耳菌株的基因組進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出167條帶，根據(jù)擴(kuò)增

6、條帶計(jì)算GS值，并構(gòu)建聚類圖。結(jié)果顯示在0.64的相似水平上，34個(gè)菌株可分為5類，并不完全按照地區(qū)分類，東北的6個(gè)菌株聚在一起;其中黑金、黑圓可認(rèn)為是同一菌株。該結(jié)果說明南北兩個(gè)栽培地區(qū)菌種交流頻繁，東北地區(qū)栽培菌株遺傳背景較為單一;同株異名現(xiàn)象的存在。
　　5、34個(gè)黑木耳栽培菌株的Nei's基因多樣性指數(shù)（h）為0.2865，Shannon信息指數(shù)(I)為0.4420，菌株基因流(Nm)值較大，為2.0850，說明該34個(gè)菌