26876.橙色紅曲菌中基于pyrg標記的同源轉化系統(tǒng)的建立_第1頁
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文檔簡介

1、南昌大學博士學位論文橙色紅曲菌中基于pyrG標記的同源轉化系統(tǒng)的建立姓名：王伯華申請學位級別：博士專業(yè)：食品科學指導教師：許楊20100601AbstractInthispaper，pyrGgenefragmentwasclonedfromMonascusaurantiacusgenomicDNAusingdegenerateprimersdesignedwithCODEHOPstrategyAnditscompletesequence

2、wasobtainedbyaPCRbasedmethodforscreeningfosmidlibraryUridineauxotrophystrainsfrom彪aurantiacusAS34384wereisolatedbyresistanceto5FOAafterUVmutagenesisOnepositivecolonywasobtainedandnamedUM28，itwasfurtherconfirmedbysequenci

3、ngandtransformationTheformationofprotoplastconditionandtheregenerationofprotoplastconditionofUM28strainwereoptimized，andahomologoustransformationsystemusingpyrGasaselectionmarkerofUM28isestablishedAplasmidpGFPpyrGcontain

4、ingtheGFPexpressioncasseReWasconstructedandtransformedintoUM28protoplast，expressionoftransformedgenewasevaluatedusingtheGFPgeneThemajorfindingswereexpoundedasfollows：1AccordingtotheknownOrotidine5’phosphatedecarboxylase，

5、pyrGgenefragmentwasclonedfromMonascusaurantiacusgenomicDNAusingdegenerateprimersdesignedwithCODEHOPstrategyAnditscompletesequenceWasobtainedbyaPCR—basedmethodforscreeningfosmidlibrary(AccessionNoGU723506)Aftertheblastxco

6、mparison，theclonedgenewasconfirmedthatitwasMonascuspyrGgenewith81％sequenceidentitytothatofAspergillusflavusNRRL3357ItCanbeusedasaselectivemarkerforMonascushomologustransformationsystem；2ApyrGmutantstrainfrom肱aurantiacusA

7、S34384，namedUM28，wasisolatedbyresistanceto5FOAafterUVmutagenesisSequenceanalysisofthismutatedgenerevealedthatitcontainedapointmutationatnucleotideposition220causedsubstitutionofPr0一Ser，withinactivationofOMPdecasefunction

8、Complementationof膨aurantiacuspyrGmutantwasperformedbytransformingAspergillusoryzaepyrGgeneintoUM28，andittransformedUM28intouridineprototrophyUM28wasauridineauxotrophwimafrequencyofreversemutmionoflessthan10一，anditcouldbe

9、usedintheMonascushomologoustransformationsystem；3TheformationofprotoplastconditionandtheregenerationofprotoplastconditionofUM28strainwereoptimizedTwocomplementationplasmids，pAOPandpMAPwererespectivelytransformedintoproto

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