第14章.同位素標(biāo)記技術(shù)在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的應(yīng)用

1、第14章.同位素標(biāo)記技術(shù)在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用,中國農(nóng)業(yè)大學(xué)齊孟文,標(biāo)記探針,探針（proble) 帶有檢測標(biāo)記的，與被檢測目標(biāo)物分子具有特異性互補(bǔ)反應(yīng)性能的探測物分子或分子片斷。探針類別 核酸探針 DNA、RNA 探針 非核酸探針，抗體、蛋白質(zhì)分子標(biāo)簽等,,核酸探針,標(biāo)記類別,標(biāo)記核素,標(biāo)記單體,摻入DNA探針的常用單體標(biāo)記化合物 [?-32p]dA

2、TP，[?-32p]dCTP ， [?-32p]UTP ，[?-32p]ATP 。國內(nèi)供應(yīng)商：北京福瑞 國外供應(yīng)商： UK,標(biāo)記單體,在分子克隆操作中用于標(biāo)記核酸分子的標(biāo)記物主要是放射性同位素，如32P，33P和35S 。在摻入核苷酸的標(biāo)記過程中，只有三磷酸核苷酸的α位磷酸整合到核酸鏈中，因此使用 α 位磷酸被標(biāo)記的三磷酸核苷酸，如 [ α- 32 P]dATP 。而在標(biāo)記 5' 末端磷酸基團(tuán)的反應(yīng)中一般使用γ位磷酸

3、被標(biāo)記的 ATP 。放射性的信號通過X- 光片放射自顯影或磷屏掃描獲取。,核酸探針標(biāo)記法,1.雙鏈DNA探針 ⑴ 切口平移法 首先用DNAase I 在探針DNA雙鏈上造成缺口，然后借助于E.coli DNA聚合酶I的5`→3`外切酶活性，切去帶有5`-磷酸的核苷酸；同時利用該酶5`→3`聚合酶活性，使同位素標(biāo)記的互補(bǔ)核苷酸補(bǔ)入缺口。 這兩種活性同時作用，缺口不斷向3`方向移動，DNA鏈上的核苷酸不斷為標(biāo)記的

4、核苷酸取代，成為帶有標(biāo)記的DNA，純化除去游離脫氧核苷酸后成為標(biāo)記DNA探針。最合適的切口平移片段一般為50-500個核苷酸,產(chǎn)生均勻標(biāo)記的探針。切口平移反應(yīng)受幾種因素的影響: (a) 產(chǎn)物的比活性取決于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的質(zhì)量會影響產(chǎn)物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性, 故應(yīng)使用仔細(xì)純化后的DNA。,,,切口平移

5、法,(2)隨機(jī)引物法 通過熱變性使模板DNA 變?yōu)閱捂淒NA，隨機(jī)引物與單鏈DNA退火后，利用Klenow Fragment合成互補(bǔ)鏈。此時如果底物中dNTP的一種或幾種被 [α-32P], [α-35S], [3H] 等標(biāo)記時，那么合成的互補(bǔ)鏈DNA也被標(biāo)記。合成后的雙鏈DNA通過熱變性變成單鏈后即可用作雜交探針。,,隨機(jī)引物 法,DNA標(biāo)記法比較：,2.單鏈DNA探針,⑴ 從M13載體衍生序列合成單鏈DNA探針

6、 M13噬菌體是一種單鏈DNA噬菌體，但它在感染宿主（大腸桿菌）后，在菌體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成為雙鏈并繁殖，又以單鏈形式透出菌體，再度感染新的宿主菌。 將模板序列克隆到M13噬菌體,以特定的同用引物或人工合成寡合苷酸為引物，在[?-32P]dNTP存在下，由Klenow片斷 酶促合成標(biāo)記探針，反應(yīng)完畢后，酶切長短不一的產(chǎn)物，然后通過變性凝膠電泳與模板分離。,,⑵ 從RNA合成單鏈cDNA探針 用RNA為模板合成cDNA探針

7、所用的引物有兩種: a. 寡聚dT為引物合成cDNA探針。本方法只能用于帶Poly(A)的mRNA,并且產(chǎn)生的探針極大多數(shù)偏向于mRNA 3‘末端序列。 b. 可用隨機(jī)引物合成cDNA探針。該法可避免上述缺點(diǎn),產(chǎn)生比活性較高的探針。但由于模板RNA中通常含有多種不同的RNA分子,所得探針的序列往往比以克隆DNA為模板所得的探針復(fù)雜得多, 應(yīng)預(yù)先盡量富集mRNA中的目的序列。反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物RNA/DNA雜交雙鏈經(jīng)堿變性

8、后,RNA單鏈可被迅速地降解成小片段,經(jīng)Sephadex G-50柱層析即可得到單鏈探針。,3.寡核苷酸探針,若只知道待分離的目的基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，而對其核苷酸序列一無所知，即可設(shè)計(jì)合成寡核苷酸探針。 利用寡核苷酸探針可檢測到靶基因上單個核苷酸的點(diǎn)突變。 單一已知序列的寡核苷酸探針. 種類 許多兼并性寡核苷酸探針組成的寡核苷酸探針庫.,,4.RNA探針,許多載體如p

9、Bluescript, pGEM等均帶有來自噬菌體SP6或E.coli噬菌體T7或T3的啟動子,它們能特異性地被各自噬菌體編碼的依賴于DNA的RNA聚合酶所識別,合成特異性的RNA。在反應(yīng)體系中若加入經(jīng)標(biāo)記的dNTP，則可合成RNA探針。 RNA探針一般都是單鏈,它具有單鏈DNA探針的優(yōu)點(diǎn),又具有許多DNA單鏈探針?biāo)鶝]有的優(yōu)點(diǎn)，主要是： RNA:DNA雜交體比DNA:DNA雜交體有更高的穩(wěn)定性,所以在雜交反應(yīng)中RNA探針比相

10、同比活性的DNA探針?biāo)a(chǎn)生信號要強(qiáng)。 RNA:RNA雜交體用RNA酶A酶切比S1酶切DNA:RNA雜交體容易控制,所以用RNA探針進(jìn)行RNA結(jié)構(gòu)分析比用DNA探針效果。,5.末端標(biāo)記,（1）一種是在5`末端加成標(biāo)記法： 先用堿性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5`-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化標(biāo)記的ATP轉(zhuǎn)移加到DNA片段5`-OH上。（2）在探針3`-末端用末端轉(zhuǎn)移酶摻入一個單標(biāo)記的ddUTP。,6.PCR 擴(kuò)增標(biāo)記,在

11、PCR擴(kuò)增時加入標(biāo)記的 dNTP ，不僅能對探針 DNA 進(jìn)行標(biāo)記還可進(jìn)行大量擴(kuò)增，尤其適合于探針 DNA 濃度很低的情形。,標(biāo)記一般流程,,核酸分子雜交,互補(bǔ)的核苷酸序列通過Walson-Crick堿基配對形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子DNA分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的,可以根據(jù)所使用的探針已知序列進(jìn)行特異性的靶序列檢測。,雜交類型,Southern雜交,DNA片段經(jīng)電泳分離后,從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上,然后與探針

12、雜交。被檢對象為DNA,探針為DNA或RNA。 Southern雜交可用來檢測經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的DNA片段中是否存在與探針同源的序列,它包括下列步驟:　　(1) 酶切DNA, 凝膠電泳分離各酶切片段,然后使DNA原位變性。 　　(2) 將DNA片段轉(zhuǎn)移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。 　　(3) 預(yù)雜交濾膜,掩蓋濾膜上非特異性位點(diǎn)。 　　(4) 讓探針與同源DNA片段雜交,然后漂洗除去非特異

13、性結(jié)合的探針。 　　(5) 通過顯影檢查目的DNA所在的位置。,檢測靈敏 Southern雜交能很靈敏地檢測出低于0.1pg與32 P標(biāo)記的高比活性探針的(>109 cpm/μg)互補(bǔ)DNA。如果將10μg基因組DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上，并與長度為幾百個核苷酸的探針雜交,曝光過夜,則可檢測出哺乳動物基因組中1kb大小的單拷貝序列。,,帶有DNA片段的凝膠,,Southern 印跡雜交的技術(shù)流程,,電泳示意圖,凝膠電泳

14、,轉(zhuǎn)印方法 (1)毛細(xì)管虹吸 優(yōu)點(diǎn)是簡單,不需要用其他儀器。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移時間較長,轉(zhuǎn)移后雜交信號較弱。 (2)電泳轉(zhuǎn)印 將DNA變性后,經(jīng)電泳印移至帶電荷的尼龍膜上。優(yōu)點(diǎn)是可直接轉(zhuǎn)移較大的DNA片段，缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移中電流較大,溫度難以控制。通常只有當(dāng)毛細(xì)管和真空轉(zhuǎn)移無效時,才予以采用。 (3) 真空轉(zhuǎn)移 一般是將硝酸纖維素膜或尼龍膜放在真空室上面的多孔屏上,再將凝膠置于濾膜上,緩沖液從上面的一個貯液槽中流下,洗脫出凝膠

15、中的DNA,使其沉積在濾膜上。該法的優(yōu)點(diǎn)是快速,在30分鐘內(nèi)就能從正常厚度(4-5mm)和正常瓊脂糖濃度(<1%)的凝膠中定量地轉(zhuǎn)移出來。轉(zhuǎn)移后得到的雜交信號比Southern轉(zhuǎn)移強(qiáng)2-3倍。缺點(diǎn)是如不小心，會使凝膠碎裂, 在洗膜不嚴(yán)格時,其背景比毛細(xì)管法的要高。,,虹吸印跡,,分子雜交爐,雜交過程,,成像觀測,放射性自顯影 利用標(biāo)記核素自身的放射性射線使感光材料感光成象的過程。目前常用的方法有: 傳統(tǒng)的膠片自顯

16、影 感光屏：醫(yī)用X光片；原理：爆光過程，射線粒子使X光片乳膠基質(zhì)中均勻分布的溴化銀晶粒感光形成物點(diǎn)的潛影，然后經(jīng)顯影及定影得像圖。膠片影象可在底片上直接觀察。,,X光自顯影暗盒及圖像增強(qiáng)屏,,成像觀測,儲存磷光屏（storage phosphor screen） 一種由磷光晶體制成的影像屏（Imaging Plate)。經(jīng)射線爆光后IP以潛能儲存射線能，當(dāng)在讀取裝置下掃描讀取時， IP在掃描激光下釋放潛能發(fā)出藍(lán)綠光，光

17、強(qiáng)與爆光時射線強(qiáng)度成正比，用光電傳感器轉(zhuǎn)換電信號，再經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換成二進(jìn)制編碼信號，由計(jì)算機(jī)成象系統(tǒng)合成為影象圖。 操作：用塑料薄膜蓋電泳凝膠，貼附于裝于暗盒的磷光屏曝光，然后在成像儀上，通過掃描磷光屏上儲存的光能進(jìn)行成象。,,UVI化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng),與著名的Molecular DynamicsTM PhosphorImagerTM 系統(tǒng)是一樣，臺風(fēng)儲磷技術(shù)---磷屏Typhoon9000系列能對所有電離輻射源提供高分辨率圖像

18、并精確定量：          3H              32P          14C

19、            33P          125I           35S   

20、       18F             99mTc大成像面積，高分辯光學(xué)系統(tǒng)和靈敏的磷屏組合，為您提供可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。下圖給出的是用32P標(biāo)記的AtlasTM 微陣列(macroarray)在GP屏上的圖像。,,成像觀測,閃爍光纖屏

21、 由塑料光纖制成的板，光纖中填有鉛和發(fā)光染料，使射線能轉(zhuǎn)換為可見光光子，然后再由電荷耦合器件CCD攝像機(jī)成像。較膠片和磷光屏的分辨率好，近實(shí)時成像且需曝光量低。,成像觀測,放射性薄層掃描儀 由空間位置靈敏探測器組成核探測儀器?？捎糜诒訉游霭?、凝膠電泳轉(zhuǎn)印膜上放射性條帶的直接定位測定。,美國的Bioscan公司  AR-2000圖像掃描儀,AR2000圖像掃描儀可對所有類型同位素（包括3H）標(biāo)記的

22、TLC板、凝膠、印跡進(jìn)行直接定位定量計(jì)數(shù)測量。掃描儀采用充氣式計(jì)數(shù)器，可檢測γ和β射線的同位素。對整塊薄層層析條帶的掃描可在1分鐘內(nèi)完成。整套系統(tǒng)包括一個儀器控制和數(shù)據(jù)采集軟件，掃描結(jié)果以層析圖或2D圖像顯示，自動完成對峰的定量，并以多種方式顯示結(jié)果。·應(yīng)用于TLC板、凝膠和印跡·不需破壞TLC板即可進(jìn)行定量·對所有類型同位素（包括3H）靈敏·簡單易用的WinScan軟件·快

23、速、自動、可靠的運(yùn)行·提供出色的空間分辨率·針對1、2、3塊TLC板可選擇不同的型號·2-D彩色圖像 ·主要應(yīng)用于放射化學(xué)純度、脂類生物化學(xué)、代謝研究、酶分析、毒理學(xué)研究等領(lǐng)域。,,瑞士卡瑪 產(chǎn)地：德國,同位素薄層掃描儀 技術(shù)參數(shù)掃描面積為 400×200 mm（Gita , Rita ）50×200mm(mini Gita ,mini Rita

24、 ) 掃描速度：可選 軌道數(shù)目：1-80 檢測器：γ-radiation (BGO detector) ，ß-radiation (GM counting tube)，gasflow 檢測能量范圍：0-2000KeV 可檢測的放射物: γ-radiation (BGO scintillation probe) 背景: 129I:0.7 cps (20-100 KeV) 靈敏度: 129I : 20 Bq in 1

25、0 min 分辨率: 129I : 2-3 mm(depending on the used collimator) 可檢測的放射物: ß-radiation open proportional counting tube (Recommended for 3H -requires counting gas P10 = 90% Ar 10% Ch4) 背景: 18F : 0.1 cps 靈敏度: 18F : 10 Bq

26、 in 10 min 分辨率: 18F : 1-2 mm,防護(hù)措施,,,INSPECTOR,Northern雜交,Northern雜交與Southern雜交很相似,主要區(qū)別是被檢測對象為RNA,其電泳在變性條件下進(jìn)行,以去除RNA中的二級結(jié)構(gòu),保證RNA完全按分子大小分離。變性劑主要有3種:乙二醛，甲醛，羥甲基汞。電泳后的瓊脂糖凝膠用與Southern轉(zhuǎn)移相同的方法將RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,然后與探針雜交。,菌落原位雜交,對分散

27、在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落（100-200）進(jìn)行克隆篩選時，可采用本方法。將這些菌落歸并到一個瓊脂主平板以及已置于第二個瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經(jīng)培養(yǎng)一段時間后，對菌落進(jìn)行原位裂解。主平板應(yīng)貯存于4℃直至得到篩選結(jié)果。,,菌落原位雜交,,斑點(diǎn)雜交,斑點(diǎn)雜交是指將DNA或RNA樣品直接點(diǎn)在硝酸纖維素濾膜上,然后與核酸探針分子雜交，以顯示樣品中是否存在特異的DNA或RNA。同一種樣品經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋,還可以得到半定量的結(jié)果。所

28、以它是一種簡便、快速、經(jīng)濟(jì)的分析DNA或RNA的方法,在基因分析和基因診斷中經(jīng)常用到,是研究基因表達(dá)的有力工具。但由于目的序列未與非目的序列分離,不能了解目的序列的長度。尤其當(dāng)本底干擾較高時,難以區(qū)分目的序列信號和干擾信號。,,DNA序列分析,Sanger雙脫氧鏈終止法 Cambridge的F. Sanger于1977年發(fā)明。 基本原理： ①DNA聚合酶能夠以單鏈DNA作為模板，準(zhǔn)確合成的DNA互補(bǔ)鏈；②該酶能夠用2

29、9;，3'--雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3'-末端，從而終止其延伸反應(yīng)。在DNA測序反應(yīng)中，加入模板DNA，引物（特異性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一種ddNTP。常用Klenow大片段，無5'→3'外切酶活性。,,DNA序列分析,Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法(哈佛大學(xué)) 對一個末端標(biāo)記的DNA片段，用化學(xué)試劑在A、G、

30、C、T處特定地裂解DNA片段。把反應(yīng)分為四組，每一組反應(yīng)特異性地針對某一種或某一類堿基，并且要保證每個DNA分子平均只有一個靶堿基被修飾，這樣，在每一組反應(yīng)中都在同一個或兩個核苷酸處DNA鏈發(fā)生斷裂，由于堿基位置不同，就會產(chǎn)生一組不同長度的DNA片段。最后，經(jīng)過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影后就可讀出待測DNA的核苷酸序列。,化學(xué)修飾法,,Maxam-Gilbert法所用的化學(xué)修飾技術(shù),DNA序列分析,DNA序列分析自動化

31、 用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作為熒光劑標(biāo)記DNA引物，帶有這種引物的DNA片段能在激光誘導(dǎo)下發(fā)出熒光。按照標(biāo)準(zhǔn)的雙脫氧終止法或化學(xué)終止法進(jìn)行測序反應(yīng)，跑DNA凝膠后用計(jì)算機(jī)檢測。,,熒光標(biāo)記物,,,,,,ddGTP,ddATP,ddTTP,ddCTP,,,,,,,,,,,,,單泳道電泳及信號收集,,,,,,,,,正極,負(fù)極,,,,,,,,,,計(jì)算機(jī)排序,5ˊ,GS FLX系統(tǒng)超高通量測序技

32、術(shù)原理 GS FLX系統(tǒng)的測序原理和GS 20一樣，也是一種依靠生物發(fā)光進(jìn)行DNA序列分析的新技術(shù)：在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號釋放偶聯(lián)起來 (圖 1)。通過檢測熒光信號釋放的有無和強(qiáng)度，就可以達(dá)到實(shí)時測定DNA序列的目的。此技術(shù)不需要熒光標(biāo)記的引物或核酸探針，也不需要進(jìn)行電泳；具有分析結(jié)果快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和自動化的特點(diǎn)。,GS FL

33、X系統(tǒng)的操作過程 GS FLX系統(tǒng)提供了完整的從樣品制備到后續(xù)的生物信息學(xué)分析解決方案。 1）樣品種類：GS FLX系統(tǒng)支持各種不同來源的樣品序列測定：包括基因組DNA，PCR產(chǎn)物，BAC，cDNA，小分子RNA等等。 2）樣品DNA打斷：樣品例如基因組DNA或者BAC等被打斷成300－800 bp的片段；對于小分子的非編碼RNA，這一步驟則不需要。短的PCR產(chǎn)物則可以利用GS融合引物進(jìn)行擴(kuò)增后

34、直接進(jìn)行步驟4)的工作。 3）銜接子連接：借助一系列標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，將A和B接頭（3’和5’端具有特異性）連接到DN**段上。接頭也將在后繼的純化，擴(kuò)增和測序步驟中用到。圖中僅僅顯示了后續(xù)步驟中要用到的單鏈的DN**段。,GS FLX系統(tǒng)的操作過程 4）一條DNA片段＝一個磁珠：接頭使成百上千條DN**段結(jié)合到它們自己唯一的磁珠上，此磁珠被單個油水混合小滴包被后，在這個小滴里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，而沒有其他的競爭性或者污

35、染性序列的影響；整個DN**段進(jìn)行平行擴(kuò)增。 5）一個磁珠＝一條讀長：經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，每個磁珠上的DN**段擁有了成千上萬個相同的拷貝。經(jīng)過富集以后，這些片段仍然和磁珠結(jié)合在一起，隨后就可以放入到PicoTiterPlate板中供后繼測序使用了。 6）數(shù)據(jù)讀取和分析工具：GS FLX系統(tǒng) 在7.5小時的運(yùn)行當(dāng)中可獲得40多萬個讀長，讀取超過1億個堿基信息。GS FLX 系統(tǒng)提供三種不同的生物信息學(xué)工具對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，

36、適用于不同的應(yīng)用：例如多達(dá)3 GB序列的重測序，對比已知參考序列進(jìn)行的擴(kuò)增產(chǎn)物差異分析，及 120 MB的從頭測序工作等。,,備注,焦磷酸測序(pyrosequeneing)是通過核苷酸和模板結(jié)合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級聯(lián)反應(yīng)，促使熒光素發(fā)光并進(jìn)行檢測的測序技術(shù)。既可進(jìn)行DNA序列分析，又可進(jìn)行基于序列分析的單核昔酸多態(tài)性(single 年nueleotide polymohism，SNP)檢測及等位基因頻率測定。 焦磷酸測序

37、是由DNA聚合酶(DNAPolymerase)、三磷酸腺酰硫酸化酶(ATPsulfurylase)、熒光素酶(luciferase)和雙磷酸酶(apyrase)4種酶催化同一反應(yīng)體系的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，反應(yīng)底物為5’---磷酰硫酸(adenosines 5’phosphosuifate，ASP）,,備注,和熒光素。反應(yīng)體系還包括待測序DNA單鏈和測序引物。在每一輪測序反應(yīng)中，加人1種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻

38、人到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)(PPi)。硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驅(qū)動熒光素酶介導(dǎo)的熒光素向氧化熒光素的轉(zhuǎn)化，發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號，并由PyrogramMT轉(zhuǎn)化為一個峰值，其高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。根據(jù)加人dNTP類型和熒光信號強(qiáng)度就可實(shí)時記錄模板DNA的核昔酸序列。,DNA序列分析,DNA雜交測序法(SBH-Sequencing by hybridization) 如果

39、一段較短的DNA探針能與較長的DNA片段雜交，并形成完全的雙鏈結(jié)構(gòu)，則可認(rèn)為靶DNA上存在著相應(yīng)的互補(bǔ)序列，這就是DNA雜交測序法的基本原理。如果將一種12-mer的靶DNA與完全隨機(jī)合成的8-mer寡核苷酸探針混合雜交，在總數(shù)為48=65536種8-mer的探針群體中，僅有5種探針會與靶DNA雜交，形成完全互補(bǔ)的雙鏈分子。,DNA雜交測序法,SBH的應(yīng)用：① 可有效檢測靶DNA中的單堿基突變；② 可用于不同DNA片段之間的序列比較

40、；③ 可用于檢測不同生長發(fā)育狀態(tài)下細(xì)胞中特定基因的表達(dá)狀況；④ 可用于檢驗(yàn)傳統(tǒng)測序技術(shù)的準(zhǔn)確性。,蛋白質(zhì)研究技術(shù),Western免疫印跡 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測。對已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移

41、到固相載體（如硝酸纖維素膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。,,WB,,PCR應(yīng)用,1.PCR技術(shù)的原理 無細(xì)胞克隆法：以擬擴(kuò)增的DNA片段為模板，一對分別與模板互補(bǔ)的寡核苷

42、酸為引物，在4種脫氧核苷酸（dNTP）存在下，由DNA聚合酶在引物所結(jié)合的位置向3’方向合成新的互補(bǔ)鏈。其反應(yīng)以雙鏈DNA的變性、退火、延伸為一個循環(huán)。經(jīng)過多次循環(huán)（25-30次），便目標(biāo)DNA片段得以大量擴(kuò)增。由于每一次循環(huán)所產(chǎn)生的新鏈均可成為新的模板用于下一輪循環(huán)，故PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增加。,Mullis的PCR構(gòu)思,,,預(yù)變性(93-95?C,2-5m),變性(93-95?C,30s),復(fù)性(50-70?C,30s),延伸(

43、75?C,30-60s),總延伸(75?C,7m),,,,,,(25-35),PCR的一般過程：,經(jīng)過30次的循環(huán), 擴(kuò)增的DNA片段可達(dá)100萬倍以上。,PCR技術(shù)的原理,PCR步驟:（1）高溫變性，雙鏈DNA變性（90～95℃）成為單鏈；（2）低溫退火（37-60℃） ，引物與單鏈DNA互補(bǔ)序列結(jié)合；（3）適溫延伸，DNA聚合酶催化（70-75℃）使引物延伸。（4）重復(fù)（1）-（3）步。,PCR技術(shù)的原理,實(shí)驗(yàn)材料、儀器和

44、試劑 1.材料：含1Kb插入片段的克隆載體Pmd18-T 質(zhì)粒DNA 2.儀器：微量移液器及吸頭、PCR儀及PCR管 瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備 3.試劑：10XPCR反應(yīng)緩沖液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10μmol/L 引物1和引物2,PCR操作步驟,1.按

45、照如下體積向PCR管中按順序加入各試劑 并混勻： 10 X PCR反應(yīng)緩沖液 2.5 μL 25mmol/L MgCl2 2.0μL 10mmol/L dNTP 1.0 μL 10μmol/L 引物1 1.0 μL

46、10μmol/L引物2 1.0μL 質(zhì)粒DNA 1.0 μL Taq 0.1 μL(5U) 水補(bǔ)充至 25.0 μL,2.PCR循環(huán),,PCR儀,,3.反應(yīng)完成后,將反應(yīng)液與凝膠電泳

47、緩沖液按比例混勻,上樣電泳。,PCR操作步驟,,,,PCR應(yīng)用,,PCR應(yīng)用,2.與標(biāo)記相結(jié)合的應(yīng)用LP-PCR(labelled primers) 利用同位素、熒光素等對PCR引物進(jìn)行標(biāo)記，可用以直觀的檢測目的基因，特別適合于臨床基因診斷，同時可以檢測多種基因成分。,PCR應(yīng)用,2.與標(biāo)記相接合的應(yīng)用原位PCR (Is-PCR) 以整個細(xì)胞作為反應(yīng)體系，對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過原位雜交等不破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方