白藜蘆醇抗真菌作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:白藜蘆醇(Resveratrol,RES)是植物(主要是種子植物)在遇到真菌感染、紫外線照射等不利條件時(shí)產(chǎn)生的植物防御素,對(duì)植物本身起保護(hù)作用。隨著對(duì)白藜蘆醇研究的深入,人們多方面的研究結(jié)果證實(shí)其具有許多重要的生理活性,如:保護(hù)心血管系統(tǒng)、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎、雌激素樣作用、延緩衰老、影響骨代謝、抗癌、抑菌等作用。由于白藜蘆醇抑菌作用的研究較少,尤其是對(duì)真菌的報(bào)道甚少,并且對(duì)其作用效果和機(jī)制尚未明確,因此為了進(jìn)一步探討RES的抗

2、菌活性及其機(jī)制,我們選取真菌中的淺部感染真菌——皮膚癬菌和深部感染真菌——白假絲酵母菌生物膜進(jìn)行體外抗菌作用的研究。
　　 第一部分白藜蘆醇對(duì)皮膚癬菌抑制作用及其機(jī)制研究
　　 方法:參照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and LaboratoryStandards Institute,CLSI)推薦的《產(chǎn)孢絲狀真菌的液基稀釋法抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)方案》(M38-A),采用微量稀釋法對(duì)RES進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn),獲得白

3、藜蘆醇對(duì)羊毛狀小孢子菌(Microsporum lanosum,M.1)、石膏樣小孢子菌(Microsporum gypseum,M.g)、絮狀表皮癬菌(Epidcrmophytonfloccosum,E.f)以及串珠鐮刀菌(Fusarium moniliforme,Em)等常見皮膚癬菌的最低抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentrations,MIC),同時(shí)分別選取正常對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組的M.1應(yīng)用透射電鏡觀察RE

4、S對(duì)真菌細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的影響。
　　 結(jié)果:RES對(duì)27株M.1的MIC50和MIC90分別為0.064mg/mL、0.128mg/mL,對(duì)13株M.g的MIC50和MIC90分別為0.128mg/mL、0.256mg/mL,對(duì)11株E.f的MICso和MIC90均為0.128mg/mL。但對(duì)12株串珠鐮刀菌的作用效果卻不理想,在最高實(shí)驗(yàn)濃度下仍未對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用。通過(guò)透射電鏡可以觀察到M.1其正常對(duì)照組菌絲切面形態(tài)規(guī)

5、則,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整清晰,細(xì)胞壁邊緣整齊、完整,厚薄均勻,細(xì)胞器豐富,密度較大,細(xì)胞基質(zhì)較密,可以清晰地看到線粒體、核糖體、細(xì)胞核等;經(jīng)0.064 mg/mL的RES作用后,部分細(xì)胞的細(xì)胞壁疏松、層次不清,細(xì)胞基質(zhì)變淡,細(xì)胞外有明顯高電子致密顆粒聚集,細(xì)胞體積明顯變小,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)模糊,大部分消失,可見較多的泡狀結(jié)構(gòu);經(jīng)0.128 mg/mL的RES作用后,細(xì)胞壁缺損嚴(yán)重并剝脫破裂,細(xì)胞膜變薄,可見不規(guī)則核位于一側(cè)邊緣,核膜斷裂、溶解消失,細(xì)

6、胞器完全消失,呈現(xiàn)髓樣化、空泡化特征。
　　 RES對(duì)M.1等皮膚癬菌有良好的抑制作用,電鏡照片證實(shí)了對(duì)其抑制作用呈濃度相關(guān)性。
　　 第二部分白藜蘆醇體外抗白假絲酵母菌生物膜作用的研究
　　 方法:
　　 1白假絲酵母菌生物膜的制備
　　 2通過(guò)倒置顯微鏡、掃描電子顯微鏡觀察白藜蘆醇對(duì)白假絲酵母菌生物膜的形態(tài)學(xué)影響
　　 3 XTT減低法測(cè)定白藜蘆醇抑制白假絲酵母菌生物膜生長(zhǎng)的最小藥物濃

7、度SMIC(Sessile Minimal inhibitory concertrations,SMIC)
　　 4采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析數(shù)據(jù),利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)組及陽(yáng)性對(duì)照組OD值的組間比較進(jìn)行差異性分析。
　　 結(jié)果:
　　 1倒置顯微鏡下RES對(duì)白假絲酵母菌生物膜形態(tài)學(xué)的影響:正常對(duì)照組中,可見很多菌絲與酵母細(xì)胞,構(gòu)成密集的生物膜;在0.128mg/mlRES作用下,可見部分酵母細(xì)胞的聚集

8、,菌絲變短,酵母細(xì)胞短小;在0.256mg/ml的RES作用下,只出現(xiàn)少數(shù)的酵母細(xì)胞。
　　 2掃描電子顯微鏡下RES對(duì)白假絲酵母菌生物膜形態(tài)學(xué)的影響:從超微結(jié)構(gòu)的角度可以觀察到在正常對(duì)照組中,呈現(xiàn)較均勻、密集的真菌黏附于PVC材料上,大量真菌細(xì)胞聚集成團(tuán),密度大,成團(tuán)塊狀;進(jìn)一步放大,細(xì)胞之間有纖維樣物質(zhì)交聯(lián),此外,可見菌體的細(xì)胞壁光滑,菌體規(guī)則。實(shí)驗(yàn)組中,電鏡下菌落明顯稀疏分布,并且數(shù)量減少;進(jìn)一步放大,可見纖維樣物質(zhì)消失,

9、并且菌體的細(xì)胞壁形態(tài)欠飽滿、表面欠光滑,可見脊?fàn)钔黄?菌絲斷裂。
　　 3 RES對(duì)白假絲酵母菌生物膜SMIC
　　 隨著RES濃度遞增,其對(duì)白假絲酵母菌生物膜的抑制作用呈增強(qiáng)趨勢(shì),SM IC50(抑制生物膜50％生長(zhǎng)的最低抑菌濃度)、SMIC50(抑制生物膜80％生長(zhǎng)的最低抑菌濃度)分別是0.128、0.256mg/ml。
　　 4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)組OD值均低于陽(yáng)性對(duì)照組,當(dāng)RES濃度分別為0.064、0.12

10、8、0.256、0.512、1.024mg/ml時(shí),兩組間OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p＜0.05。當(dāng)RES濃度分別為0.016,0.032mg/ml時(shí),兩組間OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1白藜蘆醇在較低的濃度下對(duì)淺部感染真菌——皮膚癬菌和深部感染真菌——白假絲酵母菌生物膜均有很好的抑制作用,為臨床應(yīng)用和新藥研究提供有力依據(jù),有望成為臨床治療感染的一種新藥。
　　 2通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)我們初步推斷RES干

11、擾皮膚癬菌是通過(guò)干擾細(xì)胞壁的合成,抑制1,3-β-D-葡聚糖合成酶、甘露聚糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物、甲殼質(zhì)合酶或細(xì)胞壁鞘類磷脂生物合成等機(jī)制,再由破損的細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,在破壞細(xì)胞壁的同時(shí)亦可損傷細(xì)胞膜,通過(guò)與麥角甾醇結(jié)合或干擾麥角甾醇的合成,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的重要物質(zhì)如鉀離子、氨基酸和核苷酸等外漏,破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性以及膜內(nèi)的正常代謝,而當(dāng)藥物透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入菌體后,通過(guò)干擾核酸、蛋白質(zhì)等細(xì)胞器的合成,而線粒體和核膜可能首先受到影響,至出現(xiàn)細(xì)胞

12、器的完全破壞以及細(xì)胞膜的溶解,進(jìn)而影響菌體生長(zhǎng)代謝;而RES對(duì)白假絲酵母菌生物膜的抑制作用可能是其通過(guò)與生物膜黏附的表面和真菌細(xì)胞自身作用,改變兩者之間通過(guò)化學(xué)鍵、疏水性等發(fā)生受體和配體間的特異性結(jié)合,減少兩者之間的相互作用,從而導(dǎo)致真菌生物膜細(xì)胞的脫落;或者RES分子直接作用于生物膜中菌株分泌的細(xì)胞外基質(zhì)——甘露糖蛋白,使其喪失細(xì)胞之間的黏附力,影響細(xì)胞之間的疏水性,使黏附力下降,進(jìn)而再破壞菌株;或者藥物通過(guò)真菌生物膜立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中大