大團囊蟲草菌發(fā)酵菌絲活性成分分析及抗腫瘤機制研究.pdf

1、大團囊蟲草菌屬于線蟲草科，寄生在樹林下面的大團囊菌中，是我國稀貴的藥用真菌，民間主要用于治療血崩和月經(jīng)不調(diào)。由于野生資源匱乏，野外采集大團囊蟲草比較困難，近些年國內(nèi)外對于大團囊蟲草菌的研究并不是很多，缺少對其發(fā)酵菌絲系統(tǒng)的化學成分分析，也很少涉及其活性成分的作用機理。中國醫(yī)藥古籍的記載缺乏對大團囊蟲草菌物質(zhì)基礎(chǔ)的清晰闡述，嚴重制約了大團囊蟲草菌的深度開發(fā)。針對上述問題，本論文對珍貴的藥用真菌大團囊蟲草菌發(fā)酵菌絲進行了較為系統(tǒng)的化學成分分

2、析，對其中活性化合物進行了初步的抗腫瘤活性篩選和抗腫瘤作用機制研究。
　　 1.對大團囊蟲草菌發(fā)酵菌絲進行了較系統(tǒng)的化學成分分析，結(jié)合現(xiàn)代波譜技術(shù)鑒定得到14個化合物，包括2個甾醇類、4個為倍半萜類、1個蒽醌類、4個多酚類、1個酚類和2個黃酮苷類化合物，其中13個化合物首次從大團囊蟲草菌發(fā)酵菌絲中分離到。4個倍半萜類化合物是新化合物，分別被命名為大團囊蟲草菌素A、B、C和D，已經(jīng)提交了專利申請(201110111071.5)，其

3、中3個含有螺[4.5]癸烷骨架、屬于菖蒲烷型倍半萜，另一個則是血管生成抑制劑5-demethoxyfumagillol的衍生物。2個黃酮苷類化合物均為含呋喃型五碳糖的苷類，從已知數(shù)據(jù)庫的比對來看，很有可能是新的天然產(chǎn)物。同時我們又對大團囊蟲草菌萃取物的部分油狀組分進行了GC-MS分析，鑒定出了13種揮發(fā)性成分，包括1個酚類、1個烯類、1個甾醇酯類、3個長鏈不飽和脂肪酸類和7個長鏈不飽和脂肪酸酯類化合物。
　　 2.體外抗腫瘤活性

4、篩選發(fā)現(xiàn)新化合物3對HepG2、Hela和A549作用24 h后的IC50分別為36.2μg/ml、21.1μg/ml和40.2μg/ml，對于MCF-7沒有明顯殺傷作用，而化合物9對于HepG2、Hela、A549和MCF-7作用24 h后的IC50分別為39.45μg/ml、66.35μg/ml、37.9μg/ml和18.9μg/ml，且化合物3和9對于正常的人肝細胞L-02沒有明顯的生長抑制作用(IC50＞80μg/ml)。同時，

5、對多酚類化合物Daidzein抑制腫瘤細胞MDA-MB-231轉(zhuǎn)移進行了探索，并以層孔菌來源的多酚類化合物Hispolon為對照，結(jié)果表明Daidzein盡管具有抗腫瘤作用，但沒有很強的抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移活性，而Hispolon可以通過減少細胞內(nèi)金屬基質(zhì)蛋白酶-9(MMP-9)的轉(zhuǎn)錄和表達抑制MDA-MB-231細胞的轉(zhuǎn)移。
　　 3.對新化合物9(Cordycepol C)抑制肝癌細胞HepG2生長的機制進行了初步研究。發(fā)現(xiàn)Co

6、rdycepol C能誘導(dǎo)細胞染色質(zhì)濃縮并形成凋亡小體、PARP-1蛋白剪切、核內(nèi)基因組DNA斷裂和細胞膜磷脂酰絲氨酸(PS)外翻，這些凋亡典型特征的出現(xiàn)表明Cordycepol C能誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生凋亡，并且CordycepolC可以使HepG2細胞發(fā)生G2期阻滯。Cordycepol C不能激發(fā)HepG2細胞內(nèi)Caspases的活性及Caspases蛋白的剪切，而泛Caspases抑制劑Z-VAD-fmk也即不能抑制Cordy

7、cepol C對HepG2細胞的殺傷作用，也不能抑制Cordycepol C誘導(dǎo)細胞出現(xiàn)的凋亡特征，說明Cordycepol C誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生Caspase非依賴性細胞凋亡。Western blot實驗表明Cordycepol C可以誘導(dǎo)HepG2細胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax表達量的上調(diào)，同時使Bax蛋白發(fā)生線粒體轉(zhuǎn)移；細胞內(nèi)線粒體膜電位的下降呈藥物劑量依賴性和時間依賴性，線粒體內(nèi)的促凋亡因子AIF和EndoG在用藥6h后發(fā)生了核轉(zhuǎn)移