鈉鉀ATP酶α1亞單位在肝癌細胞生長調(diào)節(jié)中的作用.pdf

1、目的:本研究以肝癌HepG2細胞為靶細胞,探討天然鈉鉀ATP酶抑制劑華蟾酥毒基和鈉鉀ATP酶α1亞單位基因沉默對肝癌HepG2細胞生長和細胞周期的影響,觀察鈉鉀ATP酶下游相關(guān)信號途徑分子基因的表達變化,探討鈉鉀ATP酶α1亞單位在肝癌細胞生長調(diào)節(jié)中的作用。
　　 方法:(1)靶向鈉鉀ATP酶α1亞單位shRNA質(zhì)粒表達載體的構(gòu)建與篩選:設計、合成靶向人鈉鉀ATP酶(Na+/K+-ATPase)α1(ATP1A1)mRNA的3對

2、DNA序列,分別插入Pgenesil-3中構(gòu)建編碼ATP1A1的短發(fā)夾RNA(shRNA)質(zhì)粒表達載體shRNA-ATP1A1(ATP1A11,ATP1A12和ATP1A13),經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測序鑒定確認。篩選并確定最佳細胞接種量及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量,半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和免疫細胞熒光檢測Na+/K+-ATPaseα1表達變化,從而確定沉默效果最明顯的shRNA-ATP1A1。(2)MTT法和流式細胞術(shù)檢測沉

3、默效果最明顯的ATP1A13和華蟾酥毒基對HepG2增殖活性和細胞周期的影響。(3)形態(tài)學觀察:倒置光顯微鏡觀察細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變;熒光顯微鏡下觀察DAPI染色后的細胞形態(tài)。(4)RT-PCR檢測ATP1A13和華蟾酥毒基作用于HepG2細胞不同時間,CDK2,PCNA,eyclinA,p21,p53,c-src,Raf1,MEK1,MEK2,ERK,c-Myc mRNA的表達變化。(5)實時定量熒光PCR檢測ATP1A13和華蟾酥毒基作

4、用于HepG2細胞24 h后各基因mRNA的表達變化。(6)Western blot檢測ATP1A13和華蟾酥毒基對CDK2,PCNA,CyclinA,p53,c-Src,ERK,p-ERK和c-Myc蛋白表達的影響。
　　 結(jié)果:(1)質(zhì)粒構(gòu)建及篩選:構(gòu)建的質(zhì)粒表達載體酶切鑒定均可擴增出預期條帶,經(jīng)測序符合設計要求,構(gòu)建成功。ATP1A12和ATP1A13對所轉(zhuǎn)染的HepG2細胞中Na+/K+-ATPaseα1 mRNA和蛋白

5、表達均有抑制作用,其中ATP1A13最為明顯。實時定量熒光PCR檢測ATP1A13敲低HepG2 Na+/K+-ATPaseα1 mRNA呈時間依賴性,72 h后表達降低約90％。(2)生長抑制作用:ATP1A13和華蟾酥毒基均可抑制HepG2細胞生長。轉(zhuǎn)染試劑和陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對HepG2細胞的生長抑制不明顯。華蟾酥毒基對HepG2細胞的生長抑制作用呈時間濃度依賴性,高濃度的華蟾酥毒基(10μmol/L)對細胞抑制顯著,而低濃度(0.01

6、μmol/L)對細胞的增殖抑制作用明顯降低。經(jīng)直線回歸計算,24 h,48 h,72 h IC50分別為(3.039±0.371)、(0.758±0.102)和(0.133±0.028)μmol/L。(3)細胞周期改變:ATP1A13和華蟾酥毒基都可使HepG2細胞周期發(fā)生S期阻滯。轉(zhuǎn)染48 h和60 h,S期細胞由正常的(27.60±1.98)％升至(39.4±2.04)％和(50.2±1.95)％。華蟾酥毒基作用于HeoG2細胞6、

7、12、18和24 h,S期細胞比例分別為(32.51±2.34)％、(40.28±1.89)％、(55.27±1.98)％和(67.28±1.92)％,均高于正常對照。ATP1A13和華蟾酥毒基作用后,HepG2細胞中細胞周期相關(guān)蛋白(CDK2,CyclinA,PCNA)的含量減少,細胞周期負調(diào)控因子p21CIP1表達上升。(4)細胞形態(tài)學改變:HepG2為貼壁生長型細胞,ATP1A13和華蟾酥毒基作用后,細胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)學變化。AT

8、P1A13轉(zhuǎn)染24 h,部分細胞變圓腫脹,貼壁狀態(tài)不好;轉(zhuǎn)染36 h,細胞形態(tài)不規(guī)則、排列紊亂有少量漂浮細胞;轉(zhuǎn)染48和60 h時,絕大部分細胞出現(xiàn)空泡現(xiàn)象,細胞間失去正常的接觸抑制,細胞碎片增多;轉(zhuǎn)染72 h時,細胞大都破碎、死亡。1μmol/L華蟾酥毒基作用6 h即可見有細胞腫脹變圓;隨著作用時間的延長,腫脹細胞逐漸增多;華蟾酥毒基作用24 h后,細胞間間隙變大,細胞破碎變形、排列紊亂。熒光顯微鏡下可見ATP1A13轉(zhuǎn)染和華蟾酥毒基

9、作用后部分細胞呈現(xiàn)形態(tài)不規(guī)則,核染色質(zhì)凝集,核膜破裂等細胞形態(tài),且隨著作用時間的延長,上述改變更加明顯。(5)ATP1A13和華蟾酥毒基對HepG2細胞信號途徑分子基因mRNA表達的影響:ATP1A13轉(zhuǎn)染HepG2細胞后,MEK1,MEK2,ERK和c-Myc mRNA的表達下調(diào);p53,c-src和Rafl mRNA的表達顯著下調(diào)。華蟾酥毒基作用后,HepG2細胞Rafl和ERK mRNA的表達上調(diào);MEK1和c-Myc mRNA的

10、表達顯著上調(diào);p53和c-src mRNA的表達下調(diào)。(6)ATP13和華蟾酥毒基對HepG2細胞信號途徑分子基因蛋白表達的影響:ATP1A13作用于HepG2細胞后,與對照組細胞相比,c-Src,ERK,p-ERK和c-Myc蛋白表達下調(diào),p53蛋白的表達顯著上調(diào)。華蟾酥毒基可以下調(diào)HepG2細胞c-Src,p-ERK和c-Myc蛋白的表達,上調(diào)p53的表達。
　　 結(jié)論:(1)成功構(gòu)建靶向鈉鉀ATP酶α1亞單位基因沉默的質(zhì)粒

11、表達載體,并篩選出抑制效果最佳的表達載體ATP1A13。(2)ATP1A13和華蟾酥毒基作用于HepG2后,可以降低周期蛋白復合體(CyclinA/CDK2/PCNA complex)的含量,并上調(diào)p21CIP1的表達,使細胞周期發(fā)生S期阻滯。(4)應用ATP1A13和華蟾酥毒基處理HepG2細胞,可以上調(diào)細胞內(nèi)p53蛋白的表達,下調(diào)c-Src和p-ERK的表達,并降低c-Myc的水平,促使細胞增殖受抑。(5)ATP1A13作用于Hep