線粒體ATP酶β亞單位在急性白血病多藥耐藥中的作用及調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：急性白血病(AL)是最常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。對化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥(MDR)是AL患者治療失敗的主要原因。雖然腫瘤細(xì)胞MDR的產(chǎn)生機(jī)制已經(jīng)得到廣泛研究,一些新的耐藥逆轉(zhuǎn)措施也在臨床得以應(yīng)用,但是MDR現(xiàn)象的分子機(jī)制仍未能完全闡明,且目前臨床的耐藥逆轉(zhuǎn)措施治療效果十分有限。因此,尋找新的耐藥環(huán)節(jié)及分子靶位,并探討白血病細(xì)胞耐藥機(jī)制及逆轉(zhuǎn)措施,對于提高AL治療的有效率具有重要的臨床意義。研究表明線粒體不僅控制機(jī)體細(xì)胞的能量代謝,

2、而且在維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài),調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等過程中起著關(guān)鍵作用。線粒體ATP酶是線粒體能量轉(zhuǎn)化的核心酶,其β亞單位(β-F1-ATPase)是氧化磷酸化合成ATP的限速組分。有研究發(fā)現(xiàn)β-F1-ATPase在多種實(shí)體腫瘤中表達(dá)下降。由于線粒體ATP酶表達(dá)降低或缺失,可導(dǎo)致細(xì)胞氧化磷酸化受阻,ATP產(chǎn)生減少,線粒體相關(guān)的細(xì)胞凋亡受抑,從而使腫瘤細(xì)胞對化療和放療產(chǎn)生耐受,并“賦予”線粒體ATP酶與凋亡耐受的化療耐藥相關(guān)的新的“含義”。新近研究發(fā)現(xiàn)線

3、粒體ATP酶表達(dá)下調(diào)與結(jié)腸癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶耐藥相關(guān),然而耐藥產(chǎn)生的機(jī)制并不清楚。近年研究表明,惡性腫瘤細(xì)胞中特定基因的啟動子區(qū)域CpG島甲基化異常及基因的轉(zhuǎn)錄活性改變與MDR的形成存在著內(nèi)在聯(lián)系。我們課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn),β-F1-ATPase表達(dá)下調(diào)與慢性粒細(xì)胞白血病(CML)對阿霉素(ADR)耐藥有關(guān):進(jìn)一步研究提示β-F1-ATPase基因啟動子區(qū)域高甲基化與CML耐藥有關(guān)。
　　本研究立足于前期的[作基礎(chǔ),探討β-

4、F1-ATPase在AL患者原代細(xì)胞中的表達(dá)與臨床療效及體外對ADR藥敏性的關(guān)系,以及原代細(xì)胞β-F1-ATPase啟動子區(qū)甲基化對耐藥的影響,以期在探索AL新的潛在的耐藥機(jī)制,定位新的逆轉(zhuǎn)耐藥的分子靶點(diǎn)上有所突破。
　　第一部分線粒體ATP酶p亞單位在急性白血病患者骨髓原代細(xì)胞中的表達(dá)及與臨床療效和體外藥敏的關(guān)系
　　目的:探討線粒體ATP酶ββ亞單位(β-F1-ATPase)的異常表達(dá)在AL患者多藥耐藥中的作用。

5、　　方法:以82例AL患者為研究對象,其中包括51例急性髓細(xì)胞白血病(AML)患者和31例急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者,另設(shè)11例骨髓相對正常非血液腫瘤患者作為對照。根據(jù)臨床耐藥診斷標(biāo)準(zhǔn),將AL患者分為臨床化療敏感組和臨床化療耐藥組。分離受試者骨髓單個核細(xì)胞(BMMCs)并原代培養(yǎng)。采用實(shí)時(shí)定量PCR (RQ-PCR)和Western blot方法分別檢測AL患者BMMCs中β-F1-ATPase mRNA和蛋白的表達(dá),比較化療敏感

6、組和化療耐藥組之間β-F1-ATPase mRNA和蛋白表達(dá)水平的差異,并動態(tài)觀察6例AL患者在初治和首次復(fù)發(fā)時(shí)β-F1-ATPase mRNA表達(dá)的變化;用MTT法檢測化療敏感和化療耐藥的AL患者BMMCs體外對ADR的敏感性,并分別分析兩組AL患者BMMCs中β-F1-ATPase mRNA和蛋白表達(dá)水平與體外藥敏的相關(guān)性。
　　結(jié)果:1.β-F1-ATPase mRNA和蛋白在所有AL和對照組BMMCs中均有小同程度的表達(dá)。

7、與對照組相比,β-F1-ATPase mRNA和蛋白農(nóng)達(dá)水平在AL患者BMMCs中均顯著絳低(P＜0.01)。2.與化療敏感組AL患者相比,化療耐藥組AL患者BMMCs中β-F1-ATPase mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.05)。3.與化療敏感組AML患者相比,化療耐藥組AML患者BMMCs中β-F1-ATPase mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)。而在ALL,化療耐藥組BMMCsβ-F1-ATPase mR

8、NA和蛋白水平較化療敏感組有降低趨勢,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。4.6例初次誘導(dǎo)獲完全緩解的AL患者BMMCsβ-F1-ATPase mRNA表達(dá)水平在疾病首次復(fù)發(fā)時(shí)較初治時(shí)呈顯著性降低(P＜0.05)。5.ADR對化療敏感組和化療耐藥組AL患者原代BMMCs的平均半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為O.94μg/mL和7.39μ/mL,化療耐藥組為化療敏感組的7.9倍。6.化療耐藥組AL患者BMMCs的β-F1-ATPase mR

9、NA和蛋白表達(dá)水平與相應(yīng)的ADR體外藥敏試驗(yàn)IC50值均呈顯著性負(fù)相關(guān)(兩者r分別為-0.467與-0.628,P均小于0.05)。
　　結(jié)論:AL化療耐藥組骨髓原代細(xì)胞存在β-F1-ATPase mRNA和蛋白表達(dá)的明顯降低,這一降低與細(xì)胞體外對ADR的抵抗存在顯著相關(guān)性,提示AL化療耐藥與β-F1-ATPase活性下調(diào)相關(guān)。
　　第二部分線粒體ATP酶β亞單位基因啟動子區(qū)CpG島甲基化與急性白血病臨床耐藥的關(guān)系
　

10、　目的:探討β-F1-ATPase基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)與AL患者臨床耐藥的內(nèi)在聯(lián)系。
　　方法:以52例AL患者為研究對象(AML患者34例,ALL患者18例),另設(shè)8例骨髓相對正常非血液腫瘤患者作為對照。根據(jù)臨床耐藥診斷標(biāo)準(zhǔn),將AL患者分為化療敏感組和化療耐藥組。根據(jù)β-F1-ATPase基因啟動子區(qū)甲基化狀況,將AL患者分為甲基化組和非甲基化組。分離骨髓單個核細(xì)胞(BMMCs)并原代培養(yǎng)。采用甲基化特異性PCR(MS

11、P)和RQ-PCR分別檢測化療敏感組與化療耐藥組患者BMMCs中β-F1-ATPase基因甲基化狀況及mRNA表達(dá),比較化療敏感組和化療耐藥組之間甲基化陽性率的差異,以及甲基化組與非甲基化組之間β-F1-ATPase mRNA表達(dá)的差異;選取11例β-F1-ATPase基因呈完全甲基化且化療耐藥的AL患者,觀察其體外培養(yǎng)的BMMCs在應(yīng)用甲基化抑制劑5-氮雜胞苷(5-Aza)后對ADR耐藥逆轉(zhuǎn)情況。
　　結(jié)果:1.β-F1-ATP

12、ase基因在8例非血液腫瘤患者BMMCs中均呈非甲基化狀態(tài),甲基化陽性率為0。52例AL患者BMMCs中β-F1-ATPase基因甲基化陽性率為55.8％2. 25例化療耐藥AL患者BMMCsβ-F1-ATPase基因甲基化陽性率為76%,顯著高于27例化療敏感組AL患者(37%)(P＜0.05)。3.16例化療耐藥組AML患者BMMCsβ-F1-ATPase基因甲基化陽性率為81.3%,顯著高于18例化療敏感組AML(38.9%)(P

13、＜0.05)。4.52例AL患者、34例AML患者和18例ALL患者中,β-F1-ATPase mRNA在甲基化組患者BMMCs中的表達(dá)水平均顯著低于非甲基化組患者。5.ADR對11例化療耐藥AL患者BMMCs的IC50在5-Aza干預(yù)后(平均值3.14μg/mL)較單用ADR(平均值7.71μg/mL)顯著降低(P＜0.01);其β-F1-ATPase mRNA表達(dá)水平在5-Aza干預(yù)后(平均值0.0704)較未經(jīng)干預(yù)(平均值0.04