端粒酶催化亞單位(hTERT)對腫瘤細胞生長調控作用及其機制的研究.pdf

1、目的:端粒酶異常高表達與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關，而其催化亞單位（hTERT）是合成端粒酶全酶的限速因素。已有的研究表明，端粒酶的活性受到抑制后能夠引起腫瘤細胞生長能力下降，并伴有細胞周期阻滯及細胞凋亡。目前一些學者認為端粒酶對腫瘤細胞生長的調節(jié)作用不僅與端粒酶能夠維持端粒的穩(wěn)定性有關，很可能也通過非端粒依賴的方式進行。近年來發(fā)展起來的RNA干擾技術由于其特異性和高效性而廣泛應用于基因功能及腫瘤的基因治療等方面研究，顯示出巨大的

2、應用前景。本研究設計并化學合成了針對hTERT的siRNA，通過其對hTERT表達的特異性抑制作用，觀察對腫瘤細胞生長的影響及能否引起非端粒依賴性的細胞凋亡。并利用基因芯片技術檢測與這種凋亡相關的基因表達變化及microRNA表達的變化。以期為深入理解hTERT的作用機理提供有價值的信息。 方法:設計并化學合成針對hTERT的siRNA，通過脂質體轉染法將其導入HeLa細胞內，然后應用半定量RT-PCR、Western blot

3、ting、實時定量TRAP的方法檢測hTERI-siRNA對hTERT表達的抑制效率及對端粒酶活性的抑制效率。然后通過軟瓊脂克隆形成實驗及荷瘤裸鼠的siRNA腫瘤內注射的方法檢驗hTERT-siRNA能否抑制HeLa細胞的體外增殖能力及體內的生長能力。接著利用TUNEL，原位凋亡檢測的方法檢驗hTERT-siRNA能否誘導腫瘤細胞的凋亡。利用基因芯片檢測hTERT-siRNA引起的基因表達及microRNA表達的變化。 結果:在

4、第一部分中，半定量RT-PCR結果示，hTERT-siRNA組細胞hTERT mRNA的相對表達量為0．20，顯著小于β-gal-siRNA組的0．73及LipofectAmine only組的0．78。Western blotting結果顯示hTERT-siRNA組hTERT·myc融合蛋白的表達水平明顯低于兩個對照組。實時定量TRAP實驗結果顯示，hTERT-siRNA組端粒酶的活性僅為兩個對照組的38％。以上實驗結果說明所設計的h

5、TERT-siRNA可以特異、有效地抑制HeLa細胞中hTERT的mRNA及蛋白表達水平，并降低端粒酶的活性。在第二部分中，軟瓊脂克隆形成實驗結果顯示，hTERT-siRNA組的克隆形成數(shù)量為1．00±1．00，明顯小于β-gal-siRNA組的4．33±0．58和LipofectAmineonly組的4．00±1．00。荷瘤裸鼠腫瘤內注射siRNA治療實驗顯示，實驗結束時hTERT-siRNA組的腫瘤體積為940．12±244．2mm

6、3小于β-gal-siRNA組的2137．9±403．72mm3和LipofectAmine only組的1896．92±291．23mm3，hTERT-siRNA組的腫瘤重量0．71±0．23g小于β-gal-siRNA組的1．46±0．32g和LipofectAmine only組的1．34±0．23g。說明hTERT-siRNA能夠明顯抑制的體外細胞增殖和體內腫瘤生長。在第三部分中，TUNEL原位凋亡檢測顯示轉染后48小時，hTE

7、RT-siRNA組凋亡率為86．9％±3．5％，明顯高于β-gal-siRNA組的2．6％±2．3％和LipofectAmine only組的9．0％±2．3％，提示hTERT-siRNA可以誘導某種非端粒依賴性的凋亡?；蛐酒慕Y果顯示hTERT-siRNA組和對照組之間有54個基因的表達差異大于4倍，其中16個與細胞的凋亡過程可能相關，應用半定量RT-PcR的方法驗證了其中的6個。microRNA芯片篩選出18個在hTERT-siR

8、NA組表達而β-gal-siRNA組未表達的microRNA，1個在β-gal-siRNA組表達而hTERT-siRNA組未表達的microRNA，其中1et-7a-2、let-7a-3、let-7e、let-7i的變化可能與hTERT-siRNA誘導凋亡的表型變化相關。 結論:hTERT能夠通過某種非端粒依賴性的方式抑制腫瘤細胞凋亡，hTERT特異性的siRNA可以促進腫瘤細胞凋亡，抑制其生長。通過cDNA芯片和microRN