分子腫瘤學(xué)6端粒、端粒酶與腫瘤

1、分子腫瘤學(xué)第七節(jié) 端粒、端粒酶與腫瘤,,細(xì)胞是有壽命的。細(xì)胞學(xué)家Hayflick發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)人體的成纖維細(xì)胞，在營(yíng)養(yǎng)充分供給的情況下，細(xì)胞分裂到50代左右就停止活動(dòng)了，真正地進(jìn)入衰老期，這一發(fā)現(xiàn)似乎告訴人們?cè)诩?xì)胞內(nèi)有一口衰老鐘或細(xì)胞分裂鐘（mitotic clock)，這限定了細(xì)胞分裂的次數(shù)，也就限定了生物的壽命。 腫瘤細(xì)胞為什么具有永生的特性，它為什么可以不受限制的增殖？,研究顯示染色體端粒（telomere） 、端粒酶（t

2、elomerase）與動(dòng)物及人類的衰老、惡性腫瘤發(fā)生有高度相關(guān)性，成為發(fā)育生物學(xué)、分子腫瘤學(xué)等眾多學(xué)科關(guān)注的焦點(diǎn)。人們期望能從中尋找出抗細(xì)胞衰老和治療腫瘤的新途徑。,端粒（telomere）是真核生物染色體的天然末端，是細(xì)胞必需的遺傳組分，因?yàn)樗軌蜓a(bǔ)償染色體末端遺傳信息的丟失。早在1938年Muler用X射線處理果蠅，觀察和分析因射線輻射引起的染色體重組的頻率和類型時(shí)，發(fā)現(xiàn)染色體末端很少有缺失與倒位現(xiàn)象發(fā)生，便推斷在染色體的兩端一定

3、存在一種特殊的結(jié)構(gòu)并將它稱之為端粒。,一、端粒、端粒酶的發(fā)現(xiàn)與染色體 的末端復(fù)制機(jī)制,在復(fù)制過程中，染色體末端的堿基對(duì)會(huì)緩慢地丟失，隨著每一次的細(xì)胞分裂，染色體末端將丟失50~200個(gè)端粒核苷酸，所以在連續(xù)分裂中，染色體產(chǎn)生進(jìn)行性縮短，致使末端功能喪失和染色體不穩(wěn)定，最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老和死亡。Watton在1972年提出了染色體末端復(fù)制問題。,自然界中不同的生物有著各自巧妙的“策略”來解決DNA末端復(fù)制的難題。原核生物有的將自已

4、的DNA環(huán)化，新鏈的3’-OH端繼續(xù)向前延伸，這樣一來便可補(bǔ)上RNA引物被消除后所留下的空缺。有的通過形成多連體來達(dá)到完全復(fù)制。,一些具線性DNA的病毒，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，也恰當(dāng)?shù)剡x擇了自已的末端復(fù)制策略。如細(xì)小病毒（pariovirns）在單股DNA末端有一個(gè)正向的反向的重復(fù)序列，這一回文片段能在末端形成發(fā)卡形結(jié)構(gòu)，使得合成新鏈折回補(bǔ)齊5’端缺失。腺病毒則有一種特殊的蛋白質(zhì)與5’端共價(jià)連接，并可作為腺病毒DNA復(fù)制的起始引物。

5、,真核生物的染色體 DNA末端復(fù)制,1985年Blackburn實(shí)驗(yàn)室在四膜蟲中發(fā)現(xiàn)并純化了一種由RNA和蛋白質(zhì)組成的核糖核酸蛋白酶，它能以自身的RNA為模板，通過另一組分即依賴于RNA的DNA多聚酶的活性在染色體末端添加端粒重復(fù)順序，當(dāng)合成完畢時(shí)，該酶向遠(yuǎn)處易位，再繼續(xù)合成新的重復(fù)序列延長(zhǎng)的末端可以形成回文結(jié)構(gòu)，使得合成新鏈折回補(bǔ)齊5’端缺失，達(dá)到末端的完全復(fù)制，這就是真核生物的末端復(fù)制機(jī)制。 這種酶被稱為端粒酶。,二.

6、端粒的結(jié)構(gòu)、功能與 長(zhǎng)度調(diào)節(jié)機(jī)制,1、端粒的結(jié)構(gòu) 端粒由規(guī)則或不規(guī)則的雙鏈重復(fù)序列和最末端的一條富含G的單鏈重復(fù)序列及端粒結(jié)合蛋白組成。端粒結(jié)合蛋白分為兩類：端粒單鏈結(jié)合蛋白和端粒雙鏈結(jié)合蛋白。前者在端粒末端提供帽狀結(jié)構(gòu)以穩(wěn)定端粒；后者可能直接參與端粒長(zhǎng)度平衡的維持，是端粒延伸的負(fù)調(diào)節(jié)因子。 對(duì)于一個(gè)特定的真核生物物種，它一定具有其特征性的端粒DNA序列和平均長(zhǎng)度。研究結(jié)果表明，人類的端粒序列為[TTAG

7、GG]n，約5~20kb。,2、端粒的功能,端粒的功能主要在于維持染色體的穩(wěn)定性，此外，還參與核中的一系列活動(dòng)。如：染色體定位，轉(zhuǎn)錄抑制，異染色質(zhì)形成，起細(xì)胞有絲分裂鐘的作用，介導(dǎo)染色體復(fù)制、引導(dǎo)減數(shù)分裂時(shí)的同源染色體配對(duì)等。,3、端粒長(zhǎng)度的調(diào)節(jié)機(jī)制,改變端粒結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致端粒酶活性失常，從而控制端粒的長(zhǎng)度而DNA的不完全復(fù)制、端粒的加工和端粒的重組，則會(huì)引起端粒的縮短,端粒的延伸與無限增殖化細(xì)胞端粒長(zhǎng)度維持機(jī)制有關(guān)：①端粒酶陽性途徑

8、（telomerase-positive pathway），這類細(xì)胞端粒酶呈陽性，端粒短。②端粒酶陰性途徑（telomerase-negative pathway），這類細(xì)胞端粒酶陰性，其端粒并不縮短。,三.端粒酶的結(jié)構(gòu)、功能及 活性調(diào)控與檢測(cè),1、端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能 端粒酶是一種自身攜帶模板的反轉(zhuǎn)錄酶，在結(jié)構(gòu)上是一種核糖核蛋白（nuclear ribonuclear protein,RNP)復(fù)合物，由 RNA和蛋白質(zhì)亞

9、基組成。端粒酶的RNA 是合成端粒DNA的模板，人端粒酶RNA組分基因于1995年克隆，命名為hTR基因定位于三號(hào)染色體，約含450個(gè)堿基，包含5(CUAACCCUAAC)3具11個(gè)堿基的模板序列，每次與1.5個(gè)TTAGGG互補(bǔ)而特異地合成人染色體端粒的DNA。 hTR基因在所有體細(xì)胞中都有表達(dá)，因而hTR的表達(dá)不能說明端粒酶活性。,,其主要功能在于合成染色體端粒的重復(fù)序列，以維持端粒長(zhǎng)度的穩(wěn)定性，端粒酶也能使斷裂染色體在原位形成端

10、粒。,2、端粒酶的活性、檢測(cè)與調(diào)控,端粒酶的活性：不同的細(xì)胞，同一細(xì)胞的不同狀態(tài)及某些物質(zhì)的協(xié)同作用都可影響到端粒酶的活性。對(duì)人體正常組織、多種良性病變及惡性腫瘤組織端粒酶活性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂能力較強(qiáng)，分裂較快的組織端粒酶活性較高。胎兒時(shí)期的端粒酶有較高的活性，但在出生后不久，除生殖細(xì)胞和干細(xì)胞等少數(shù)細(xì)胞顯弱端粒酶活性外，端粒酶多處于失活狀態(tài)。絕大多數(shù)惡性腫瘤組織均顯示明顯的端粒酶活性。,端粒酶活性的檢測(cè)： 目前

11、常用的檢測(cè)方法有：同位素法、染色法、熒光法、ELISA法，也有報(bào)道用原位雜交方法檢測(cè)石蠟標(biāo)本的端粒酶基因表達(dá)獲得與生化活性測(cè)定相一致的結(jié)果。 端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法（telomere repeat amplification protocol,TRAP)是將端粒延伸與PCR結(jié)合起來的方法，在此基礎(chǔ)上又發(fā)展了TRAP-ELISA法等,端粒酶活性的調(diào)控：,端粒酶活性的內(nèi)在調(diào)節(jié)端粒酶在正常人體細(xì)胞的失活與在惡性腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)，說

12、明體內(nèi)端粒酶調(diào)控機(jī)制的存在端粒重復(fù)結(jié)合因子（telomeric repeat binding factor,TRF)1和2是與端粒特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，其中TRF1是端粒長(zhǎng)度的負(fù)向調(diào)控因子，其通過阻礙端粒酶與端粒的結(jié)合而發(fā)揮作用，而TRF2是端粒的保護(hù)因子。端錨酶（tankyrase,TRF1-interactin)是一種DNA核糖聚合酶，可與TRF1結(jié)合，把與端粒結(jié)合的TRF1從端粒上移開，從而使端粒酶發(fā)揮作用端粒酶的活性調(diào)控還與細(xì)

13、胞周期、細(xì)胞分化進(jìn)程，細(xì)胞中蛋白磷酸化反應(yīng)、凋亡調(diào)控基因如bcl-2、c-myc等的調(diào)控有關(guān)。雌、孕激素的水平的變化也參與了調(diào)節(jié)。人3號(hào)染色體上可能存在端粒酶的抑制基因，當(dāng)將人3號(hào)染色體導(dǎo)入腎癌細(xì)胞株，則出現(xiàn)細(xì)胞端粒酶活性喪失，細(xì)胞失去無限制生長(zhǎng)能力。,端粒酶活性的外在調(diào)節(jié)細(xì)胞中加入端粒酶RNA組份的反義寡核苷酸，使端粒酶的活性受到抑制；改變DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)或在細(xì)胞中加入陽離子卟啉，妨礙端粒酶與端粒結(jié)合，從而間接抑制端粒酶活性；使

14、用蛋白激酶(PKC)抑制劑抑制端粒酶的活性 ；通過破壞端粒酶的DNA錨著區(qū)，抑制端粒酶活性。,四.端粒、端粒酶與衰老的關(guān)系,人類細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的缺失將導(dǎo)致端?？s短，這種縮短使得端粒最終成為不能被細(xì)胞識(shí)別的末端。但這并不是說端粒不存在了，而是說端粒縮短到了一個(gè)“關(guān)鍵長(zhǎng)度”，端粒一旦短于此長(zhǎng)度，就很有可能導(dǎo)致染色體雙鏈的斷裂，并激活細(xì)胞自身的檢驗(yàn)系統(tǒng)，從而使細(xì)胞進(jìn)入死亡危機(jī)狀態(tài)。,隨著端粒的進(jìn)一步丟失，將會(huì)發(fā)生染色體重排、 雙著絲粒

15、染色體和非整倍染色體的形成等錯(cuò)誤， 這將導(dǎo)致進(jìn)一步的危機(jī)產(chǎn)生。,如果細(xì)胞試圖要維持其正常的分裂，那么就必須阻止端粒的進(jìn)一步丟失，并且激活端粒酶。因?yàn)橹挥羞@樣細(xì)胞才能進(jìn)行正常的染色體復(fù)制。因此，只有那些重新獲得端粒酶活性的細(xì)胞才能繼續(xù)生存下去。對(duì)于那些無法激活端粒酶（即無法阻止端粒進(jìn)一步丟失）的細(xì)胞將只能面臨趨向衰老死亡的結(jié)果。,,,染色體DNA,端粒,端粒,（Kbp）

16、 干細(xì)胞 種系細(xì)胞端粒酶呈陽性 正常體細(xì)胞端粒酶呈陰性 M1 =5-7 轉(zhuǎn)化事件 M2 =2-4

17、 永生化腫瘤細(xì)胞端粒酶呈陽性 Hyflick極限期（M1） 危機(jī)期（M2）復(fù) 制 年 齡 端粒丟失與衰老關(guān)系模型,端粒限制性片斷長(zhǎng)度,“端粒-端粒酶”假說基于端粒在細(xì)胞壽命中的作用，Harley提出了“端粒-端粒酶”假說。在細(xì)胞有絲分裂過程中，伴隨著部分端粒序列的丟失，端粒長(zhǎng)度縮短。當(dāng)端?？s短至一定長(zhǎng)度時(shí)

18、，可能觸發(fā)某種信號(hào)，使細(xì)胞進(jìn)入Hayflick限制或第一死亡期（M1期）(mortality stage 1)，此時(shí)細(xì)胞不再分裂并出現(xiàn)老化。如果細(xì)胞被病毒轉(zhuǎn)化，或者某些抑癌基因的突變，細(xì)胞越過M1期繼續(xù)分裂，端粒繼續(xù)縮短，最終達(dá)到一個(gè)關(guān)鍵閾值，細(xì)胞進(jìn)入M2期(mortality stage 2) 。這時(shí)，染色體可能出現(xiàn)異常形態(tài)，某些細(xì)胞因端粒太短喪失功能而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但極少數(shù)細(xì)胞在此階段激活了端粒酶，端粒功能得以恢復(fù)，染色體穩(wěn)定，從而

19、逃避M2危機(jī)，獲得永生化。,1994年發(fā)現(xiàn)端粒酶僅在人卵巢細(xì)胞中表達(dá)，而在正常卵巢細(xì)胞中缺乏，才真正開始意識(shí)到端粒、端粒酶在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要性。,五.端粒酶的活性與惡性腫瘤,近年來，人們對(duì)人體惡性腫瘤組織端粒酶的活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，絕大多數(shù)惡性腫瘤組織均顯示明顯的端粒酶活性，而在正常細(xì)胞株和癌旁組織標(biāo)本中端粒酶幾乎全部為陰性。這有力佐證了端粒酶的激活在維持細(xì)胞永生化、促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展方面所具有的重要意義。端粒端粒酶與細(xì)胞永

20、生和腫瘤的關(guān)系可用M1/M2假說來解釋，即細(xì)胞獲得永生化必須克服兩個(gè)死亡危機(jī)期。端粒酶特異地表達(dá)于各種腫瘤細(xì)胞，是大多數(shù)腫瘤細(xì)胞持續(xù)分裂所必需的，因此，端粒酶活性是診斷多數(shù)惡性腫瘤、判斷愈后的良好指標(biāo)。,端粒酶可作為腫瘤早期診斷的指標(biāo)人們?cè)噲D抑制端粒酶活性來治療腫瘤，它可能比目前所使用的化學(xué)療法和基因療法具更大的優(yōu)勢(shì)。端粒酶抑制劑具有較高的特異性和較少的副作用，并具有廣譜性。傳統(tǒng)療法對(duì)早期腫瘤最有效，而端粒酶抑制劑可能對(duì)晚期和擴(kuò)

21、散腫瘤也有效。端粒酶活性的監(jiān)測(cè)可作為判斷腫瘤腫瘤大小、惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤的分級(jí)及預(yù)后的重要指標(biāo)體外研究發(fā)現(xiàn)端粒酶活性與腫瘤細(xì)胞的分化呈負(fù)相關(guān),端粒、端粒酶與腫瘤研究中遇到的幾個(gè)基本問題：,在端粒酶陽性細(xì)胞中，端粒酶是腫瘤細(xì)胞形成的原因還是結(jié)果，在端粒酶陰性的腫瘤細(xì)胞中，通常具較長(zhǎng)的端粒，其端粒又是怎么合成與維持的。在有的永生細(xì)胞系中觀察到端粒長(zhǎng)度的突然大幅度增長(zhǎng)或縮短，而端粒酶的活性卻無變化。這些情況提示了還有不依賴端粒酶