腫瘤的早期診斷——端粒酶活性的檢測.pdf

1、中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文腫瘤的早期診斷——端粒酶活性的檢測姓名：郝鳳進(jìn)申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：于秉治2001.4.1關(guān)蛋白(TP1TLPI).最近有學(xué)者發(fā)現(xiàn):端粒酶三各組分中hTRT的逆轉(zhuǎn)錄活性是端粒酶活性的決定因素，故檢TmRNA可反應(yīng)端粒酶的活性，進(jìn)而對惡性腫瘤做出判斷文根據(jù)文獻(xiàn)報道的hTRTcDNA序列設(shè)計(jì)引物，建立了hTRTcDNA的RT一KR檢測法，并初步研究了腫瘤脫落細(xì)胞的hTRTmRNA的表達(dá)

2、情況。材料與方法1本實(shí)驗(yàn)建立了RT一PCR方法，探討了反應(yīng)的擴(kuò)增動力學(xué)，檢測了大量的尿液，胸水的端粒酶活性。1.材料腫瘤患者的尿液和胸水均來自于中國醫(yī)大附屬一院患者。2.方法:2.1總RNA提取:取尿液或胸水50m1，用TRIzol，異丙醇，抓仿等提取總RNA，提出的總RNA用20川DEPC處理過的水稀釋后，取2討留做進(jìn)行紫外檢測，其余的分裝后放在一20℃保存。2.2用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行紫外測定總RNA含量及純度。2.3CDNA第一鏈的

3、合成，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，反應(yīng)體積為10貝。2.4擴(kuò)增hTRTcDNA片段，用反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用PCR方法擴(kuò)增hTRTcDNA片段，其引物為:上游引物序列為5’一cTGCACTGGCTGAGTGT一3下游引物序列為5’一CTGAACAGTGCCTTCACCCT一3反應(yīng)總體積為25wlo2.5電泳檢側(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增后的產(chǎn)物加樣到12%的聚丙烯酞胺凝膠中，電壓80V90分鐘，之后用EB(澳化乙錠)染色。實(shí)驗(yàn)