端粒與端粒酶在硼替佐米和ARID1A抑制腫瘤進(jìn)展中的功能學(xué)研究.pdf

1、端粒是位于真核染色體末端，由短的DNA重復(fù)序列TTAGGG和相關(guān)蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物。其主要作用是保護(hù)染色體，既可防止染色體被核酸酶降解，同時(shí)又能阻止相鄰染色體間的融合。另外，端粒的長度反應(yīng)細(xì)胞的可分裂次數(shù)，因此，被稱為細(xì)胞的“生命鐘”。正常情況下，端粒DNA會(huì)隨著細(xì)胞的每次分裂而縮短50-200個(gè)堿基對，當(dāng)其縮短到一定長度時(shí)，染色體則無法完成正常復(fù)制，細(xì)胞的有絲分裂也會(huì)隨之停滯，轉(zhuǎn)而進(jìn)入衰老階段。端粒酶是一種RNA依賴的DNA聚合酶，由

2、催化組分端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)、端粒酶模板RNA(hTER)以及端粒酶相關(guān)蛋白質(zhì)組成，其主要作用是延長端粒的長度。在正常的成熟體細(xì)胞中，端粒酶幾乎沒有活性，但是，在病理狀態(tài)下，如腫瘤細(xì)胞中，其活性異常增高，使端粒長度得以延長，從而保證了腫瘤細(xì)胞的無限分裂增殖。由此可見，端粒酶活性的異常升高所導(dǎo)致的端粒長度的維持，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　硼替佐米是已經(jīng)應(yīng)用于臨床的用來治療多發(fā)性骨髓瘤的一種藥物，作為26S蛋白酶體的抑制

3、劑，其已知的主要作用機(jī)制是通過抑制NF-κB信號(hào)途徑，進(jìn)而激活caspase3,同時(shí)抑制抗凋亡基因bcl-2的表達(dá)，來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。雖然硼替佐米在多發(fā)性骨髓瘤的治療中已經(jīng)取得了良好療效，但仍有部分耐藥病例出現(xiàn)，因此，我們亟需尋找硼替佐米新型的作用機(jī)制以及靶點(diǎn)分子，以使其獲得更加合理的臨床應(yīng)用。
　　腫瘤抑制因子arid1a是染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合體SWI/SNF的重要組成成分，可結(jié)合于DNA的特定區(qū)域，此復(fù)合體中的另一成員BRG1或

4、BRM可水解ATP產(chǎn)生能量，利用這些能量，SWI/SNF重構(gòu)復(fù)合體可使染色質(zhì)中核小體的組蛋白核心發(fā)生移位甚至脫落，從而轉(zhuǎn)移核小體的位置，改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)象，使下游基因的轉(zhuǎn)錄起始部位暴露或隱藏，由此來調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄。目前，眾多的基因測序結(jié)果顯示，在卵巢癌、胃癌、腎癌、胰腺癌等絕大多數(shù)腫瘤中都存在ARID1A基因的突變或缺失，這提示arid1a可能作為一種抑癌基因來行使作用。但是，具體的抑癌機(jī)制目前研究尚少。
　　研究目的：

5、　　1.探討硼替佐米誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的過程中，對端粒酶活性和端粒功能的影響，以發(fā)掘其新的作用機(jī)制，并對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生硼替佐米耐藥過程中hTERT所發(fā)揮作用進(jìn)行研究。
　　2.探討胃癌細(xì)胞中arid1a對hTERT表達(dá)的調(diào)控及其相關(guān)機(jī)制，為arid1a的抑癌作用提供證據(jù)支持。
　　研究方法和結(jié)果:
　　1.硼替佐米降低端粒酶活性和端粒穩(wěn)定性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡
　　(1)硼替佐米抑制腫瘤細(xì)胞端粒酶活性，同時(shí)降低其端粒穩(wěn)定

6、性。
　　硼替佐米處理白血病細(xì)胞HEL和胃癌細(xì)胞BGC-823前后，分別用PCR-ELISA試劑盒檢測端粒酶活性，qRT-PCR檢測hTERT、hTER及端粒結(jié)合蛋白TRF1、TRF2、POT1、RAP1、TPP1及TIN2的mRNA表達(dá)，Western Blotting檢測 TRF1、TRF2、POT1的蛋白表達(dá)，流式-熒光原位雜交(Flow-FISH)和qPCR檢測端粒長度，免疫-熒光原位雜交(Immuno-FISH)檢測端粒

7、DNA的損傷。結(jié)果表明，硼替佐米可下調(diào)hTERT、hTER的mRNA表達(dá)水平，降低端粒酶活性，使端粒結(jié)合蛋白的表達(dá)廣泛失調(diào)，縮短端粒長度并導(dǎo)致端粒功能異常。
　　(2) hTERT高表達(dá)可減弱由硼替佐米引起的端粒功能異常。
　　硼替佐米處理穩(wěn)定高表達(dá)hTERT基因的細(xì)胞株HEL-hTERT、BGC-823-hTERT后，F(xiàn)low-FISH和qPCR檢測細(xì)胞端粒長度，Immuno-FISH檢測端粒DNA損傷，qRT-PCR檢測

8、端粒結(jié)合蛋白TRF1、TRF2、POT1、RAP1、TPP1及TIN2的mRNA表達(dá)，Western Blotting檢測TRF1、TRF2、POT1的蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，硼替佐米處理后HEL-hTERT和BGC-823-hTERT細(xì)胞中端粒長度無明顯改變，端粒DNA損傷和端粒結(jié)合蛋白的表達(dá)失調(diào)程度明顯弱于相同濃度硼替佐米處理的HEL-control和BGC-823-control細(xì)胞。
　　(3) hTERT高表達(dá)可抑制由硼替佐

9、米所誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　硼替佐米處理穩(wěn)定高表達(dá)hTERT基因的細(xì)胞株HEL-hTERT、BGC-823-hTERT與對照細(xì)胞株HEL-control、BGC-823-control后，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)確定細(xì)胞的存活率，Annexin-Ⅴ染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果表明，硼替佐米處理后，HEL-hTERT和BGC-823-hTERT細(xì)胞的存活率明顯高于HEL-control和BGC-823-control細(xì)胞，而HEL

10、-hTERT和BGC-823-hTERT細(xì)胞的凋亡比例明顯低于HEL-control和BGC-823-control細(xì)胞。
　　(4) hTERT通過減弱DNA損傷和上調(diào)bcl-2表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　硼替佐米處理穩(wěn)定高表達(dá)hTERT基因的細(xì)胞株HEL-hTERT、BGC-823-hTERT與對照細(xì)胞株HEL-control、BGC-823-control后，免疫熒光檢測DNA損傷，即53BP1的凝集，Western

11、Blotting檢測bcl-2的表達(dá)。結(jié)果表明，HEL-hTERT與BGC-823-hTERT細(xì)胞中的DNA損傷明顯少于HEL-control與BGC-823-control細(xì)胞，HEL-hTERT細(xì)胞內(nèi)bcl-2表達(dá)明顯高于HEL-control細(xì)胞，且在硼替佐米處理后HEL-hTERT細(xì)胞內(nèi)仍存留較多量的bcl-2蛋白。
　　2.染色質(zhì)重構(gòu)分子ARID1A負(fù)性調(diào)控hTERT抑制胃癌進(jìn)展
　　(1) arid1a負(fù)性調(diào)控h

12、TERT表達(dá)。
　　胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和SGC中轉(zhuǎn)染arid1a高表達(dá)或?qū)φ召|(zhì)粒PcDNA6.0后，采用qRT-PCR和western blotting分別檢測hTERT的mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，arid1a高表達(dá)后，hTERT的mRNA及蛋白表達(dá)均下降。
　　(2) arid1a抑制hTERT啟動(dòng)子活性。
　　AGS和SGC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染arid1a高表達(dá)或?qū)φ召|(zhì)粒PcDNA6.0后，再轉(zhuǎn)染hTERT啟動(dòng)子報(bào)告基

13、因質(zhì)粒，然后采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測hTERT啟動(dòng)子活性。結(jié)果表明，arid1a高表達(dá)后，hTERT啟動(dòng)子活性明顯降低。
　　(3) arid1a抑制c-myc在hTERT啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合，但不改變c-myc的表達(dá)量。
　　AGS和SGC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染arid1a高表達(dá)或?qū)φ召|(zhì)粒PcDNA6.0后，qRT-PCR檢測c-myc的mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示arid1a未影響c-myc的mRNA水平。在轉(zhuǎn)染了arid1a高表達(dá)或?qū)φ?/p>

14、質(zhì)粒PcDNA6.0的AGS和SGC細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染c-myc結(jié)合位點(diǎn)突變的hTERT啟動(dòng)子質(zhì)粒，用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測突變的hTERT啟動(dòng)子活性，結(jié)果顯示，其活性未受arid1a高表達(dá)的影響。
　　研究結(jié)論:
　　1.硼替佐米可以通過降低HEL和BGC-823細(xì)胞的端粒酶活性和端粒穩(wěn)定性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而hTERT可減弱硼替佐米對端粒功能的影響，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對硼替佐米的耐藥。
　　2.Arid1a通過阻礙c-myc在