人端粒酶hTERT可誘導(dǎo)RNAi系統(tǒng)的建立及其對(duì)TREx-hela細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響.pdf

1、端粒(telomere)是真核生物染色體線性DNA分子末端的特殊結(jié)構(gòu)，對(duì)維持染色體穩(wěn)定性和DNA完整復(fù)制具有重要作用。端粒酶是一種能以自帶RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA并加于染色體末端的核糖核蛋白。端粒酶調(diào)節(jié)亞單位hTERT對(duì)端粒酶活性有限速效應(yīng)。端粒酶延長(zhǎng)端粒重復(fù)片段能阻止端粒長(zhǎng)度隨細(xì)胞分裂逐漸縮短，維持染色體穩(wěn)定，使細(xì)胞具有永生化特性。目前研究表明端粒酶不但和機(jī)體衰老有關(guān)，也可能與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展有重大關(guān)系。 RNA

2、干擾(RNAinterference，RNAi)作用是生物體內(nèi)的一種通過雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)分子在mRNA水平上關(guān)閉特異性序列的基因表達(dá)或使其沉默的過程。目前RNA干擾技術(shù)在基因功能分析、抗腫瘤和抗病毒的方面有著十分廣泛的應(yīng)用前景，被Science雜志評(píng)為2002年度世界十大科學(xué)成就之首。 RNA干擾技術(shù)可為基因功能研究提供重要的信息，但這種信息只是“全或無”的。在很多情況下，需要研究

3、基因在不同表達(dá)水平上對(duì)細(xì)胞的影響，因此需要一個(gè)可以調(diào)控的RNA干擾系統(tǒng)來解決這個(gè)問題。Tet-on可誘導(dǎo)性RNAi干擾系統(tǒng)含有可以被tet抑制子(tetrepressor，TR)和四環(huán)素調(diào)節(jié)的Hl/TO啟動(dòng)子。在表達(dá)TR的細(xì)胞中，啟動(dòng)子被抑制，通過加入四環(huán)素或者類似物到培養(yǎng)基中，可以解除抑制作用，從而產(chǎn)生RNA干擾效應(yīng)。 在本課題中，首先建立了含有可以被tet抑制子TR和四環(huán)素調(diào)節(jié)的Hl/TO啟動(dòng)子的Tet-on可誘導(dǎo)性RNA

4、干擾系統(tǒng)。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建針對(duì)hTERT的可誘導(dǎo)性RNA干擾系統(tǒng)，建立了可誘導(dǎo)性沉默hTERT的細(xì)胞株，并且初步探討了端粒酶活性下降對(duì)TREx-Hela細(xì)胞株在細(xì)胞增殖和凋亡方面的影響。 本課題建立的可誘導(dǎo)性沉默hTERT的RNA干擾系統(tǒng)，為進(jìn)一步研究端粒酶與細(xì)胞增殖調(diào)控之間的關(guān)系提供了基礎(chǔ)。 第一章構(gòu)建可誘導(dǎo)性沉默hTERT的重組體 方法：1.根據(jù)NCBI提供的Hl啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)tet-on四環(huán)素誘導(dǎo)性H

5、1啟動(dòng)子，即在Hl啟動(dòng)子的TATA盒兩側(cè)加上四環(huán)素操作子TetO2，并在合成的序列兩端加上SpeI和NcoI的酶切位點(diǎn)。酶切RNAi載體psiRNA-hHlneo，插入tet-on四環(huán)素誘導(dǎo)型Hl啟動(dòng)子序列替換原來的Hl啟動(dòng)子。tet-on可誘導(dǎo)性RNAi載體psiRNA-hHl/TOneo構(gòu)建完成。 2.根據(jù)NCBI提供的hTERT基因序列，并對(duì)目的序列進(jìn)行篩選，將選出的序列在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，選定3組RNA干擾片

6、段。合成后退火，分別連接到psiRNA-hHl/TOneo中，沉默端粒酶催化亞基hTERT的tet-on可誘導(dǎo)性RNAi載體psiRNA-hHl/TO-hTERTshRNA構(gòu)建完成。 結(jié)果：1.通過酶切鑒定和測(cè)序分析，tet-on可誘導(dǎo)性RNAi載體psiRNA-hH1/TOneo啟動(dòng)子序列與設(shè)計(jì)序列一致。 2.通過酶切鑒定和測(cè)序分析，插入psiRNA-hH1/TOneo的3段shDNA序列與設(shè)計(jì)序列一致。

7、 第二章建立可誘導(dǎo)沉默hTERT的TREx-hela細(xì)胞株 以及檢測(cè)方法：1.將構(gòu)建好的psiRNA-hHl/TO-hTERTshRNA1，2，3分別轉(zhuǎn)染入表達(dá)TR的TREx-hela細(xì)胞，用G418篩選陽性細(xì)胞克隆。 2.用半定量RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞hTERT的轉(zhuǎn)錄后水平，并對(duì)其端粒酶活性進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果：1.建立了分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染psiRNA-hHl/TO-hTERTshRNA1，2，3的TREx-he

8、la細(xì)胞株。 2.RT-PCR和端粒酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示3個(gè)細(xì)胞株中，未誘導(dǎo)組細(xì)胞hTERT的mRNA含量未見下降，端粒酶活性未見降低；而誘導(dǎo)組細(xì)胞hTERT的mRNA含量下降，端粒酶活性降低。 第三章hTERT沉默對(duì)TREx-hela細(xì)胞增殖和凋亡的影響 方法：1.細(xì)胞的處理：3組細(xì)胞分別設(shè)立誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組，誘導(dǎo)組加1ug/ml四環(huán)素誘導(dǎo)。 2.MTT法檢測(cè)誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組以及對(duì)照組的增殖情況。

9、 3.Hochest33342染色觀察不同組細(xì)胞的凋亡發(fā)生情況。 4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡發(fā)生情況。 結(jié)果：1.MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：3個(gè)細(xì)胞株中未誘導(dǎo)組細(xì)胞增殖能力未見明顯改變；而誘導(dǎo)組細(xì)胞增殖后期有減緩趨勢(shì)。 2.Hochest33342染色及流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果示：各組細(xì)胞凋亡率無明顯差別。 結(jié)論1.構(gòu)建了具有可被四環(huán)素誘導(dǎo)的tet-on可誘導(dǎo)性RNAi載體psiRNA-hHl