葛根素對初級感覺神經(jīng)元P2X-,3-受體介導(dǎo)的痛覺傳遞的影響和機制研究.pdf

1、1、研究背景
　　 疼痛(pain)包括痛覺和痛反應(yīng),是臨床上大多數(shù)疾病共有并最常見的癥狀之一,主要表現(xiàn)為機體對損傷組織或潛在的損傷所產(chǎn)生的一種不愉快的反應(yīng)。在臨床上,疼痛的分類十分復(fù)雜。按疼痛的性質(zhì)、起因和時程,疼痛可分為急性疼痛和慢性疼痛。急性疼痛主要表現(xiàn)為疾病或組織損傷所致的急性癥狀,為各種傷害性刺激作用于機體傷害性感受器而導(dǎo)致的疼痛,故又稱之為傷害感受性疼痛。臨床上常見于手術(shù)創(chuàng)傷、燒傷、燙傷、急性炎癥、心肌梗死、臟器穿孔

2、、分娩等引起的疼痛。而慢性疼痛是指引起傷害性刺激的損傷痊愈而疼痛卻依然存在的一種狀態(tài),臨床表現(xiàn)為其本身就是一種疾病,常見于神經(jīng)源性疼痛(神經(jīng)病理性疼痛)、慢性腰腿痛、晚期癌性痛等。另外,基于病理學(xué)特征,可將疼痛劃分為傷害感受性疼痛(nociceptive pain)和神經(jīng)病理性疼痛(neuropathicpain)。傷害感受性疼痛的產(chǎn)生與組織損傷或炎癥有關(guān),又稱為炎癥性疼痛,屬于急性疼痛。而神經(jīng)病理性疼痛屬于慢性疼痛,其產(chǎn)生機制比較復(fù)雜

3、,主要是由于外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的直接損傷或功能紊亂所引起。疼痛表現(xiàn)為人對傷害性刺激的一種主觀感受,常常與其他疾病伴隨發(fā)生,如果伴隨神經(jīng)異常,則提示可能存在神經(jīng)病理性因素或神經(jīng)損傷等,而表現(xiàn)為神經(jīng)病理性疼痛,為臨床最常見的難治性疼痛。神經(jīng)病理性疼痛分類復(fù)雜、類型較多,主要分為周圍性神經(jīng)病理性疼痛和中樞性神經(jīng)病理性疼痛。臨床上,神經(jīng)病理性疼痛通常表現(xiàn)為一種慢性疾病,比較難診斷,而且尚缺乏有效的治療措施,常規(guī)止痛藥一般不能有效緩解疼痛,因此很

4、難治愈。因此,臨床上常常面臨著治療無效或效果不佳的尷尬,給患者帶來了極大的痛苦,嚴(yán)重影響患者正常工作和同常生活,極大地降低患者的生活質(zhì)量,對醫(yī)療服務(wù)亦是個巨大的負(fù)擔(dān)。燒傷是臨床常見的一種嚴(yán)重的急性創(chuàng)傷,常伴有劇烈疼痛。燒傷、燙傷引起的疼痛是一種特殊類型的急性外傷性疼痛,一般在燒傷、燙傷后最初1小時內(nèi)出現(xiàn),并伴隨著出現(xiàn)在燒傷后的整個治療過程中。嚴(yán)重?zé)齻髮?dǎo)致嚴(yán)重而且持續(xù)性的疼痛(基礎(chǔ)痛),并且還要在數(shù)周乃至數(shù)月內(nèi)經(jīng)歷令人難以忍受的創(chuàng)面處

5、理引起的疼痛(操作痛)。燒傷痛是燒傷患者所經(jīng)歷的最難以忍受的痛苦和最常見的臨床癥狀,其控制不當(dāng)將可導(dǎo)致患者的精神預(yù)后不良,甚至有自殺行為和暴力傾向,而且嚴(yán)重的會引起燒傷病人并發(fā)癥的產(chǎn)生甚至死亡。但目前臨床上對燒傷痛的治療遠(yuǎn)不盡人意,尋找更有效、更實用和更經(jīng)濟的方法治療燒傷痛,成為燒傷治療的重要組成部分。目前,國際上認(rèn)為疼痛是繼呼吸、脈搏、血壓、體溫之后的第五個生命體征,為生命體征的重要指標(biāo);疼痛治療亦成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一個重要組成部分,并已

6、逐漸發(fā)展成為疼痛治療學(xué)。然而,目前化學(xué)藥物鎮(zhèn)痛仍是最主要的疼痛治療手段,主要包括阿片類鎮(zhèn)痛藥、中樞作用的非阿片類鎮(zhèn)痛藥、作用于外周的抗炎鎮(zhèn)痛藥和復(fù)方抗炎鎮(zhèn)痛藥。但阿片類等鎮(zhèn)痛藥物的副作用,如呼吸抑制、惡心、嘔吐、嗜睡、尿潴留等發(fā)生率較高,而且長期應(yīng)用易產(chǎn)生藥物耐受與依賴以及突然停藥導(dǎo)致的戒斷綜合征等。因此,在臨床上如何規(guī)范疼痛治療是每一位醫(yī)師必須認(rèn)真對待的問題,尋找以新的鎮(zhèn)痛藥物成為目前醫(yī)務(wù)工作者的研究熱點和面臨的首要任務(wù)。研究發(fā)現(xiàn),傷

7、害感受器上表達(dá)許多與疼痛和感覺過程有關(guān)的分子,特別是嘌呤受體中的P2X3受體在背根感覺神經(jīng)元特異表達(dá),與感覺神經(jīng)木梢釋放的ATP(P2X受體激動劑)結(jié)合而參與疼痛的信息傳遞,由此表明脊髓背根初級感覺神經(jīng)元在疼痛的感知和傳遞中發(fā)揮著重要的作用。嘌呤與嘧啶受體包括P1和P2受體,腺苷為腺嘌呤核苷酸前體和代謝產(chǎn)物,主要激活P1受體,而ATP及其類似物作用于P2受體。一般認(rèn)為,外周神經(jīng)損傷、傷害性刺激等使損傷細(xì)胞、應(yīng)激細(xì)胞以及感覺神經(jīng)末梢本身釋

8、放大量ATP,刺激感覺神經(jīng)元P2X2/3受體或P2X3受體,使感覺神經(jīng)末梢去極化,引起感覺神經(jīng)元放電增強而產(chǎn)生痛覺。由此提示,不同類型細(xì)胞釋放的ATP能通過激活感覺神經(jīng)終末上的P2受體(尤其是P2X3受體或P2X2/3受體),在疼痛的發(fā)生機制中起到一定作用。因此,P2嘌呤受體的激動劑和拮抗劑具有廣闊臨床應(yīng)用前景,特異性的P2X3受體阻斷劑將可能成為痛覺等病理狀態(tài)下新的治療藥物。葛根為豆科植物野葛的干燥根,氣味甘、辛、平,無毒;具清熱解毒

9、、升陽解肌、透疹止瀉之功效。而葛根素(Puerarin)是從葛根中提取的一種黃酮苷,化學(xué)名為4,7-二羥基-8-β-D-吡喃葡萄糖醛基異黃酮,臨床上主要用于心肌梗塞、冠心病、心絞痛等心血管疾病及視網(wǎng)膜動/靜脈阻塞、突發(fā)性耳聾和糖尿病等病癥的治療。文獻(xiàn)報道,以葛根為主藥的葛根湯具有抗炎作用;關(guān)節(jié)腔內(nèi)聯(lián)合注射類固醇和葛根素可顯著地提高骨關(guān)節(jié)炎治療的遠(yuǎn)期療效。疼痛是炎癥的表現(xiàn),而炎癥與傷害性反應(yīng)密切相關(guān),由此提示從葛根中提取的葛根素可能具有抗

10、傷害性反應(yīng)和鎮(zhèn)痛的作用。本實驗將通過建立大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷(CCI)和淺Ⅱ度燒傷模型,觀察葛根素對實驗?zāi)Ｐ痛笫蟮臋C械痛敏和熱痛敏等行為學(xué)的影響,同時采用免疫組化、原位雜交、RT-PCR和Western Blot技術(shù)觀察葛根素對P2X3受體介導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛和燒傷痛的作用;并結(jié)合急性傷害性行為學(xué)研究,觀察葛根素對P2X3受體介導(dǎo)的大鼠急性傷害性反應(yīng)的影響。通過這些實驗以期了解葛根素對初級感覺神經(jīng)細(xì)胞P2X3受體介導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛

11、、燒傷痛和急性傷害性疼痛的作用,擴大中藥葛根素的應(yīng)用范圍,為臨床上神經(jīng)病理性疼痛、燒傷痛和急性傷害性疼痛等急、慢性疼痛的防治探尋新的鎮(zhèn)痛藥物提供實驗依據(jù)。
　　 2、葛根素對P2X3受體介導(dǎo)的急性傷害性反應(yīng)的作用
　　 目的:觀察葛根素(puerarin,PUE)對初級感覺神經(jīng)細(xì)胞嘌呤2X3(P2X3)受體介導(dǎo)的急性傷害性反應(yīng)的影響。
　　 方法：通過大鼠痛行為反應(yīng)確定鞘內(nèi)應(yīng)用葛根素對P2X3受體激動劑ATP、α

12、,β亞甲三磷酸腺苷(α,β-meATP)和福爾馬林(formalin)所致大鼠足底傷害性反應(yīng)的影響;同時應(yīng)用免疫組化和RT-PCR方法,觀察葛根素對炎性物質(zhì)福爾馬林所致傷害性行為反應(yīng)大鼠的L4-L6段背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)P2X3受體表達(dá)的影響。
　　 結(jié)論：葛根素可通過抑制初級感覺神經(jīng)元P2X3受體興奮介導(dǎo)的傷害性信號傳遞產(chǎn)生抗傷害性反應(yīng)作用。
　　 3、葛根素對P2X3受體介導(dǎo)

13、的神經(jīng)病理性疼痛的作用
　　 目的:觀察葛根素對P2X3受體介導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛的作用。
　　 方法：建立大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(Chronic constriction injury,CCI)模型(結(jié)扎右后肢),實驗大鼠隨機分為正常大鼠對照組(Ctrl)、假手術(shù)對照組(Sham)、正常大鼠葛根素處理對照組(Ctrl+PUE)、CCI模型組(CCI)和CCI模型+葛根素處理組(CCI+PUE)等5組。應(yīng)用Von Fr

14、ey細(xì)絲法和熱輻射法觀察葛根素對CCI大鼠機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold,MWT)和熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency,TWL)的影響,結(jié)合免疫組化、蛋白印跡、原位雜交和RT-PCR方法觀察各組實驗大鼠右側(cè)(即結(jié)扎側(cè))L4/L5段背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)P2X3受體蛋白和mRNA表達(dá)的變化。
　　 結(jié)論：葛

15、根素對初級感覺神經(jīng)元P2X3受體介導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛具有抑制作用。
　　 4、葛根素對P2X3受體介導(dǎo)的燒傷痛的作用
　　 目的:探討葛根素對P2X3受體介導(dǎo)的燒傷痛的作用。
　　 方法：建立大鼠淺Ⅱ度燒傷動物模型(右后肢或背部燙傷),實驗大鼠隨機分成10組,每組6只。其中足部假燙組(Sham paw burn,SPB)、無足部燙傷葛根素處理對照組(puerarin-treated paw unburned co

16、ntrol,PPC)、足部淺Ⅱ度燙傷組(untreated superficial second degree paw burn,UPB)、足部淺Ⅱ度燙傷葛根素處理組(puerarin-treated superficial second degree paw burn,PPB)和足部燙傷空白對照組(blank paw control,BPC)用于行為學(xué)研究,背部假燙組(sham back burn,SBB)、無背部燙傷葛根素處理對照組

17、(puerarin-treated back unburned control,PBC)、背部淺Ⅱ度燙傷組(untreated superficial second degree back burn,UBB)、背部淺Ⅱ度燙傷葛根素處理組(puerarin-treated superficial second degree back burn,PBB)和背部燙傷空白對照組(blank back control,BBC)用于免疫組化、原位雜

18、交或分子生物學(xué)等研究。應(yīng)用Von Frey細(xì)絲法和熱輻射法測定各組實驗大鼠右后肢機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold,MWT)和熱縮足反射潛伏期(thermalwithdrawal latency,TWL),觀察葛根素對淺Ⅱ度燒傷大鼠MWT和TWL的影響。結(jié)合免疫組化、蛋白印跡、原位雜交和RT-PCR方法分別觀察各組大鼠背部燙傷區(qū)背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)P