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1、目的:培養(yǎng)新生大鼠嗅感覺神經(jīng)元(olfactory receptor neurons,ORNs),觀察BDNF、NGF對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育的影響,為可再生ORNs快速增殖提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù),這將為研究神經(jīng)元的損傷修復(fù)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、嗅覺障礙的治療等開辟一條新的途徑。 方法:取Wistar大鼠(出生3~4天,重8~10g)嗅黏膜,經(jīng)酶消化法分離嗅細(xì)胞后,加MEMD-va-line培養(yǎng)基聯(lián)合10%胎牛血清(FBS)及阿糖胞苷培養(yǎng)ORNs。并
2、將其分成四組,分別是神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)組;腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(brain derived neuro-trophic factor,BDNF)組;NGF和BDNF聯(lián)合組;對(duì)照組(只含血清的培養(yǎng)液)。應(yīng)用神經(jīng)微絲蛋白(neurofilament protein,NFP)、嗅覺標(biāo)記蛋白(olfactory marker protein,OMP)行免疫組化檢測(cè)及電鏡技術(shù)鑒定ORNs。在細(xì)胞培養(yǎng)5、8
3、、11天,采用顯微鏡下目測(cè)微尺測(cè)量雙極細(xì)胞突起長(zhǎng)度及不同形態(tài)細(xì)胞數(shù)量的變化。采用Western Blot檢測(cè)成熟ORNs的特異性標(biāo)記蛋白-OMP,進(jìn)而發(fā)現(xiàn)ORNs表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,作多因素方差分析,比較各級(jí)間細(xì)胞突起長(zhǎng)度差異,并作t檢驗(yàn)分析。 結(jié)果:新生大鼠嗅黏膜經(jīng)酶消化法分離后,MEMD-valine培養(yǎng)基聯(lián)合10%的胎牛血清及阿糖胞苷,可以有效抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。在不同時(shí)間點(diǎn),顯微鏡下顯
4、示ORNs形態(tài)變化,胞體透亮,細(xì)胞狀態(tài)好且數(shù)量多;OMP、NFP標(biāo)記雙極細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng);掃描電鏡清晰地顯示雙極樣細(xì)胞的突起及細(xì)胞分裂狀態(tài);目測(cè)微尺測(cè)量雙極細(xì)胞突起長(zhǎng)度和不同形態(tài)細(xì)胞數(shù)量的變化,NGF組與BDNF組細(xì)胞突起長(zhǎng)度對(duì)比P>0.05,其余組間對(duì)比P<0.01,圓形與梭形細(xì)胞NGF組與對(duì)照組對(duì)比P>0.05;Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示:聯(lián)合組細(xì)胞ORNs蛋白含量高于NGF組及對(duì)照組。 結(jié)論:BDNF、NGF的聯(lián)合
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