PAR4在初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元的表達(dá)及對(duì)TRPV1調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、目的：蛋白酶活化受體4(PAR4)為G蛋白偶聯(lián)受體，參與多種病理生理的過(guò)程。最近研究發(fā)現(xiàn)PAR4在外周炎癥和疼痛調(diào)節(jié)中具有重要作用。以培養(yǎng)的大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)感覺(jué)神經(jīng)元為研究模型，研究PAR4在初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元的表達(dá)。觀察PAR4受體及其活化的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制，以及與傷害性感覺(jué)受體瞬時(shí)電位香草酸受體亞型1(TRPV1)之間的相互關(guān)系，從而為進(jìn)一步闡明PAR4參與外周痛信號(hào)的調(diào)節(jié)作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：⑴以急性分離、培養(yǎng)大鼠

2、的DRG感覺(jué)神經(jīng)元為研究模型，利用免疫熒光的方法結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)，研究PAR4和TRPV1在體外培養(yǎng)的大鼠DRG感覺(jué)神經(jīng)元的表達(dá)以及兩者的共存。⑵Trizol裂解法提取培養(yǎng)的DRG感覺(jué)神經(jīng)元總RNA，用RT-PCR檢測(cè)PAR4基因的表達(dá)以及PAR4激動(dòng)劑對(duì)PAR4和TRPV1基因表達(dá)的影響，及PKA信號(hào)通道對(duì)PAR4表達(dá)和PAR4介導(dǎo)TRPV1基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。⑶RIPA細(xì)胞裂解液提取培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元總蛋白，檢測(cè)PAR4激動(dòng)

3、劑對(duì)PAR4和TRPV1蛋白表達(dá)的影響以及PKA信號(hào)通道對(duì)PAR4表達(dá)和PAR4影響TRPV1蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。
　　 結(jié)果：①年輕雄性Wistar大鼠，體重約100g，急性分離DRG，快速取雙側(cè)DRG，消化、吹打，制成細(xì)胞懸液，種置于六孔培養(yǎng)板觀察不同時(shí)間段細(xì)胞的數(shù)量，大小以及突起的長(zhǎng)度。接種于六孔培養(yǎng)板的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)作用，倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)部分神經(jīng)細(xì)胞已貼壁，貼壁的神經(jīng)細(xì)胞為圓形或橢圓形，胞體周?chē)幸蝗鈺?，尚無(wú)

4、突起。神經(jīng)元的細(xì)胞核位于細(xì)胞中央或胞體一側(cè)，核仁明顯。接種24小時(shí)后，大部分細(xì)胞已貼壁，貼壁細(xì)胞長(zhǎng)出小突起，除單個(gè)散布的神經(jīng)細(xì)胞外，常可見(jiàn)幾個(gè)或多個(gè)神經(jīng)細(xì)胞聚在一起，它們向四周發(fā)出樹(shù)枝狀突起。培養(yǎng)3-4天的神經(jīng)細(xì)胞的突起逐漸延長(zhǎng)增粗，可看到神經(jīng)細(xì)胞的突觸交織在一起形成稀疏的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)細(xì)胞突起的主干和分枝都明顯延長(zhǎng)并增粗，神經(jīng)細(xì)胞突起形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得更加稠密，神經(jīng)細(xì)胞胞體逐漸增大。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量會(huì)減

5、少。②免疫熒光組織化學(xué)結(jié)合激光共聚焦結(jié)果顯示，在體外培養(yǎng)的大鼠DRG神經(jīng)細(xì)胞，可見(jiàn)大量的感覺(jué)神經(jīng)元表達(dá)PAR4，PAR4陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量和形態(tài)變化與上述體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元類(lèi)似。培養(yǎng)1天的陽(yáng)性細(xì)胞多為一些中小神經(jīng)元，直徑為11-28微米，也偶可見(jiàn)一些大型神經(jīng)元表達(dá)PAR4，形態(tài)呈圓形或橢圓形。培養(yǎng)24小時(shí)后，PAR4陽(yáng)性神經(jīng)元生長(zhǎng)突起出現(xiàn)，培養(yǎng)3-4天DRG神經(jīng)元可出現(xiàn)PAR4陽(yáng)性軸突。陽(yáng)性標(biāo)記物主要出現(xiàn)在細(xì)胞膜、細(xì)胞漿，細(xì)胞核未見(jiàn)表達(dá)

6、。③在體外培養(yǎng)的大鼠DRG的神經(jīng)細(xì)胞，培養(yǎng)1天的TRPV1陽(yáng)性細(xì)胞與PAR4陽(yáng)性細(xì)胞相似，可見(jiàn)大量的中、小型TRPV1陽(yáng)性神經(jīng)元胞體，形態(tài)呈圓形或卵圓形。TRPV1的陽(yáng)性物分布于細(xì)胞膜、細(xì)胞漿，細(xì)胞核未見(jiàn)標(biāo)記。DRG培養(yǎng)24小時(shí)后，可見(jiàn)TRPV1陽(yáng)性的樹(shù)突和軸突。熒光雙標(biāo)結(jié)合激光共聚焦結(jié)果顯示：體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元均可見(jiàn)PAR4/TRPV1雙標(biāo)記。對(duì)30個(gè)培養(yǎng)孔蓋玻片上的DRG細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示：有65.3％±3.2％(162/248)PA

7、R4陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)TRPV1，同樣，TRPV1陽(yáng)性神經(jīng)元也表達(dá)PAR4，細(xì)胞計(jì)數(shù)有95％±2.4％(162/171)TRPV1陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)PAR4。④PAR4激動(dòng)劑對(duì)PAR4在初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元表達(dá)的影響：將PAR4激動(dòng)劑AYPGKF-NH2(10μM)加入培養(yǎng)的DRG神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)作用1小時(shí)，Western blot結(jié)果顯示：PAR4激動(dòng)劑使PAR4蛋白的表達(dá)量增加，加PAR4激動(dòng)劑組與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RT-PC

8、R結(jié)果顯示：加PAR4激動(dòng)劑組與空白對(duì)照組相比PAR4mRNA的表達(dá)量增加1.2倍，加PAR4激動(dòng)劑組與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。⑤PKA激動(dòng)劑和抑制劑對(duì)PAR4表達(dá)的影響：將PKA激動(dòng)劑(forskolin1μM)和抑制劑(PHKI14-223μM)分別孵育培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞，作用30min后，再加入PAR4激動(dòng)劑孵育1小時(shí)，Western blot結(jié)果顯示：加PKA激動(dòng)劑和抑制劑組與加入PAR4激動(dòng)劑組相比都使PAR4

9、蛋白表達(dá)量減少，但加PKA激動(dòng)劑組的PAR4蛋白的表達(dá)量相對(duì)于加入PKA抑制劑的DRG神經(jīng)元PAR4表達(dá)減少，加入PKA抑制劑的PAR4蛋白的表達(dá)量與加入PKA激動(dòng)劑組DRG神經(jīng)元PAR4表達(dá)增加。加入PKA激動(dòng)劑和抑制劑組和空白對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示：PKA激動(dòng)劑組和PKA抑制劑組相比，加入PKA激動(dòng)劑的PAR4mRNA的表達(dá)量減少，加入PKA抑制劑的PAR4mRNA的表達(dá)量增加。加入PKA激動(dòng)

10、劑組與空白對(duì)照組相比PAR4mRNA的表達(dá)量減少，加入PKA抑制劑組與空白對(duì)照組相比PAR4mRNA的表達(dá)量增加1.17倍。加入PKA抑制劑組和空白對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。⑥PAR4激動(dòng)劑對(duì)TRPV1表達(dá)的影響，將PAR4激動(dòng)劑AYPGKF-NH2(10μM)加入培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)作用1小時(shí)，Western blot結(jié)果顯示：DRG神經(jīng)元TRPV1蛋白的表達(dá)量與空白對(duì)照組相比下降58％(n=3)，加PAR4激動(dòng)劑組與空白

11、對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示：PAR4激動(dòng)劑使TRPV1mRNA的表達(dá)量減少與空白對(duì)照組相比下降20％(n=3)，加PAR4激動(dòng)劑組與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：⑴體外培養(yǎng)的大鼠DRG初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元表達(dá)PAR4。許多PAR4陽(yáng)性神經(jīng)元與TRPV1共存。⑵AYPGKF-NH2可上調(diào)PAR4蛋白和mRNA在DRG初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元的表達(dá)。PKA激動(dòng)劑可抑制AYPGKF-NH2