P2X-,3-受體介導(dǎo)骨癌痛痛覺(jué)敏化機(jī)制的研究.pdf

1、疼痛是癌癥患者最為常見(jiàn)的癥狀之一,據(jù)統(tǒng)計(jì),大約30-50％的癌癥患者會(huì)有中到重度疼痛,尤其是晚期癌癥的患者,約75-95％會(huì)發(fā)生難以控制的慢性疼痛。不少癌癥患者就診時(shí)的首要癥狀就是疼痛。由于癌癥痛的機(jī)制尚不明了,仍約有45％的癌癥痛得不到有效控制,因此研究癌癥痛機(jī)制,尋找緩解癌癥痛的新方法,提高腫瘤患者生存質(zhì)量,成為當(dāng)前急需解決的問(wèn)題。臨床最常見(jiàn)的三大腫瘤為肺癌、乳腺癌、前列腺癌,此類(lèi)腫瘤晚期很容易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移,而骨癌痛則是慢性癌痛最為常

2、見(jiàn)的一種,因此從研究骨癌痛的發(fā)生發(fā)展機(jī)制入手揭開(kāi)癌癥痛的機(jī)制有重要的臨床意義。 2002年Medhurst等首先建立了大鼠骨癌痛模型,為探索骨癌痛的發(fā)生機(jī)制,尋找有效的治療方法提供了良好的機(jī)遇。但其所用的MRMT-1乳腺癌細(xì)胞國(guó)內(nèi)較難獲得,因而不少學(xué)者仍在探索新的腫瘤細(xì)胞株來(lái)建立大鼠骨癌痛模型。本課題組前期研究采用Walker256細(xì)胞探索建立大鼠的骨癌痛模型取得了成功。在模型動(dòng)物中,荷瘤側(cè)肢體表現(xiàn)出負(fù)重減少、異常性疼痛或痛覺(jué)過(guò)

3、敏等相關(guān)行為學(xué)改變,其程度與骨質(zhì)破壞程度密切相關(guān),與臨床癌癥痛表現(xiàn)出相似特征。而相應(yīng)的脊髓節(jié)段也發(fā)生一些特征性的神經(jīng)化學(xué)改變,提示骨癌痛是一種特殊類(lèi)型的疼痛,神經(jīng)傳遞通路上存在有痛覺(jué)敏化機(jī)制。 近年來(lái)在疼痛機(jī)制的研究中P2X受體的作用逐漸受到重視,P2X嘌呤受體為ATP的受體,是配體門(mén)控陽(yáng)離子通道,有7個(gè)亞單位,其中P2X3亞單位高度選擇性表達(dá)于小直徑的感覺(jué)神經(jīng)元,與痛覺(jué)信號(hào)傳遞密切相關(guān)。那么ATP及其P2X3受體是否參與了骨癌

4、痛的痛覺(jué)敏化機(jī)制昵?某些研究提示了一些線索,Maehara等發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中ATP含量明顯高于正常組織,而Gilchrist等在小鼠骨癌痛模型中進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其周?chē)窠?jīng)末梢纖維P2X3受體表達(dá)顯著增多,而且從神經(jīng)纖維的分類(lèi)上看主要表現(xiàn)為與肽能神經(jīng)纖維共表達(dá)增加。這些發(fā)現(xiàn)似乎暗示著P2X3可能參與了骨癌痛痛覺(jué)敏化的外周敏化機(jī)制。由于脊髓背根神經(jīng)節(jié)(DRG)是初級(jí)感覺(jué)傳入神經(jīng)元胞體所在地,因而本研究計(jì)劃從DRG入手研究骨癌痛痛覺(jué)敏化機(jī)

5、制。 本課題分四個(gè)步驟：(1)通過(guò)大鼠脛骨內(nèi)注射walker256乳腺癌細(xì)胞建立骨癌痛模型并觀察其行為學(xué)變化的特點(diǎn)；(2)觀察DRG神經(jīng)元中P2X3受體mRNA和蛋白表達(dá)情況；(3)利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)分析DRG神經(jīng)元P2X3受體功能的變化；(4)利用在體實(shí)驗(yàn)運(yùn)用P2X3受體的阻斷劑suramin鞘內(nèi)注射是否能夠緩解骨癌痛。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)探討P2X3受體是否和如何參與了骨癌痛的痛覺(jué)敏化過(guò)程。 結(jié)果： 1.模型建立情

6、況 雌性Wistar大鼠脛骨內(nèi)接種2×105個(gè)Walker256細(xì)胞,接種腫瘤后(PID)21d統(tǒng)計(jì)致瘤率70％,大鼠PID10天開(kāi)始出現(xiàn)自發(fā)痛(SPAS)評(píng)分增高,在PID14～21天出現(xiàn)明顯的跛行或后肢不負(fù)重,部分大鼠對(duì)患側(cè)足有自噬現(xiàn)象,同時(shí)伴有進(jìn)食減少,體重下降；誘發(fā)痛實(shí)驗(yàn)主要表現(xiàn)為機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏而無(wú)明顯的熱痛覺(jué)過(guò)敏,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。影像學(xué)觀察PID 8天時(shí)尚無(wú)明顯改變,至PID21d時(shí)可見(jiàn)骨質(zhì)明顯增生,病理檢查可見(jiàn)晚期脛

7、骨外觀呈膨脹性增生,脛骨內(nèi)有腫瘤生長(zhǎng),同時(shí)有破骨和成骨樣改變。脊髓切片GFAP染色見(jiàn)患側(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生。以上結(jié)果表明大鼠骨癌痛模型成功建立,模型主要行為學(xué)特征為機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏和自發(fā)性運(yùn)動(dòng)疼痛。 2.P2X3受體在DRG神經(jīng)元中的表達(dá) 免疫熒光標(biāo)記見(jiàn)骨癌痛模型組患側(cè)L4～L5節(jié)段DRG神經(jīng)元P2X3在PID14天、21天時(shí)表達(dá)明顯增高,主要表達(dá)在中、小直徑神經(jīng)元。對(duì)照組、假手術(shù)組、骨癌痛組14天、21天P2X3受體陽(yáng)

8、性神經(jīng)元百分比率分別為30.71％、32.3％、48.78％和46.27％。western blot實(shí)驗(yàn)與免疫組化結(jié)果一致,對(duì)照組、假手術(shù)組、骨癌痛組14天、21天P2X3受體表達(dá)相對(duì)量(P2X3/β-actin)分別為0.58±0.16,0.56±0.17,1.26±0.25,1.30±0.43。realtime RT-PCR骨癌痛模型組P2X3 mRNA在PID 14天、21天時(shí)明顯增高但兩者之間無(wú)顯著差異。以上結(jié)果提示骨癌痛大鼠在

9、PID 14至21天疼痛行為學(xué)改變明顯時(shí)DRG神經(jīng)元中P2X3受體表達(dá)也是增加的,且這種增加可能與P2X3 mRNA表達(dá)增加有關(guān)。 3.P2X3受體電生理功能的變化 骨癌痛組DRG神經(jīng)元的形態(tài)及被動(dòng)膜電生理特性包括膜電容、靜息電位等與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異,但由αβ-me-ATP 100μM引發(fā)的內(nèi)向電流明顯增強(qiáng),有反應(yīng)細(xì)胞的比率增高,這種內(nèi)向電流可以被suramin 30μM阻斷。以反應(yīng)時(shí)程為基礎(chǔ),內(nèi)向電流可以區(qū)分為快

10、反應(yīng)、慢反應(yīng)和混合反應(yīng)型電流,骨癌痛組DRG神經(jīng)元中三種反應(yīng)類(lèi)型電流所占百分比率沒(méi)有顯著差異。 4.在體應(yīng)用P2X3受體阻斷劑的結(jié)果 PID14～16d鞘內(nèi)連續(xù)給予suramin 50μg/天可明顯緩解骨癌痛大鼠的機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏,痛閾明顯提高,接近正常對(duì)照水平,而suramin對(duì)正常大鼠痛閾無(wú)顯著影響。 結(jié)論: 根據(jù)以上結(jié)果可以得出如下結(jié)論： 1.脛骨內(nèi)接種Walker256乳腺癌肉瘤細(xì)胞可以成功

11、構(gòu)建大鼠脛骨骨癌痛模型,其行為學(xué)特征主要表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛和機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏。 2.P2X3參與了骨癌痛大鼠的痛覺(jué)敏化機(jī)制 (1)骨癌痛大鼠痛覺(jué)行為學(xué)改變與其脊髓背根神經(jīng)節(jié)中P2X3表達(dá)顯著增高有關(guān),而后者可能與P2X3 mRNA表達(dá)增加有密切關(guān)系。 (2)骨癌痛大鼠DRG中P2X3電生理功能增強(qiáng),主要表現(xiàn)為P2X3激動(dòng)劑αβ-me-ATP引發(fā)的內(nèi)向電流增強(qiáng)及有反應(yīng)細(xì)胞的比率增高。 (3)鞘內(nèi)運(yùn)用P2X3受體