重組葡萄球菌腸毒素對(duì)豬先天免疫功能的影響.pdf

1、葡萄球菌腸毒素（SEs）作為超抗原能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，引起機(jī)體廣泛的炎癥反應(yīng)。腸毒素作用迅速、產(chǎn)生炎癥能力強(qiáng)，暗示其可能影響先天免疫應(yīng)答機(jī)制介導(dǎo)適應(yīng)性免疫，促進(jìn)炎癥的產(chǎn)生。Toll樣受體（TLRs)作為先天免疫模式識(shí)別受體，在先天性早期抗感染、炎癥反應(yīng)及調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫中有重要作用，但TLRs對(duì)葡萄球菌腸毒素刺激的應(yīng)答反應(yīng)尚不清楚。本文研究了重組葡萄球菌腸毒素對(duì)豬先天性免疫分子TLR轉(zhuǎn)錄表達(dá)、其介導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)的影響，以探討腸毒素引發(fā)先

2、天免疫應(yīng)答的分子機(jī)制，主要研究結(jié)果如下：
　　應(yīng)用RT-PCR方法從豬肺泡巨噬細(xì)胞中克隆了8種Toll樣受體（TLR1、2、4、5、6、8、9、10）全基因，利用生物信息學(xué)技術(shù)分析其單核苷酸多態(tài)性（SNPs）和氨基酸功能區(qū)，預(yù)測(cè)TLR蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)及其配體識(shí)別域，從結(jié)構(gòu)角度分析突變氨基酸對(duì)TLR功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLR基因序列具有個(gè)體差異性和種屬特異性，其非同義突變主要位于胞外區(qū)，推測(cè)其病原識(shí)別具有多樣性。預(yù)測(cè)的8種TLR分子均為

3、I型跨膜蛋白，胞外區(qū)富含亮氨酸重復(fù)序列（LRRs）；二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊組成；TLR單體和二聚體分別為馬蹄形和“M”形。
　　設(shè)計(jì)TLR1-10及先天免疫應(yīng)答相關(guān)分子IL-1β、MCP-1、MIP-1β、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4的特異性引物，建立了檢測(cè)上述分子轉(zhuǎn)錄變化的相對(duì)熒光定量PCR方法（qRT-PCR），從特異性、敏感性、重復(fù)性等方面優(yōu)化了PCR條件。結(jié)果顯示退火溫度為50℃時(shí)，c

4、DNA濃度在初始濃度或2倍稀釋時(shí)，各因子Ct值處于最適范圍且熒光強(qiáng)度高，溶解度曲線無雜峰，產(chǎn)物電泳條帶單一，各基因組間和組內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)變異系數(shù)均保持在3.5％以內(nèi)。
　　運(yùn)用相對(duì)熒光定量PCR和ELISA分別檢測(cè)了腸毒素對(duì)豬先天免疫分子TLR1-10、多種細(xì)胞因子體內(nèi)外轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的影響。MTT實(shí)驗(yàn)表明葡萄球菌腸毒素可促進(jìn)豬淋巴細(xì)胞增殖，腸毒素可導(dǎo)致體外培養(yǎng)的肺泡巨噬細(xì)胞TLR1、2、6、10 mRNA轉(zhuǎn)錄顯著增加，通過活化TLR途

5、徑產(chǎn)生大量促炎因子，如IL-1β、TNF-α、克隆刺激因子（GM-CSF）、趨化因子（MCP-1）及炎性因子MIP-1β、IL-2、IL-4、IFN-γ等；體內(nèi)檢測(cè)的外周血淋巴細(xì)胞（PBMC）轉(zhuǎn)錄TLR1-10、MCP-1、IL-2、IL-4、IFN-γ等的能力增強(qiáng)，形成細(xì)胞因子風(fēng)暴。通過注射不同腸毒素的腸結(jié)扎實(shí)驗(yàn)表明，5種腸毒素（SEU除外）均能引起豬小腸不同程度的水腫，炎性細(xì)胞增多，細(xì)胞間隙增大；不同腸毒素處理腸段TLR6轉(zhuǎn)錄均上調(diào)