葡萄球菌B型腸毒素中毒救治的藥物研究.pdf

1、背景:金黃色葡萄球菌B型腸毒素(SEB)作為金黃色葡萄球菌產生的一種重要的外毒素,中毒劑量低,人的致吐劑量僅為0.4μg/kg,是胃腸道強有力的致病毒素。對 SEB攝取的劑量以及途徑的不同,會導致不同的中毒效果,包括普通的食物中毒、急性和致死性呼吸衰竭以及毒素中毒性休克綜合癥等。近年來腸毒素污染造成的突發(fā)公共事件也一直困擾著人們,對人類健康、社會經濟發(fā)展的威脅越來越大,造成的損失也越來越大。該毒素通過呼吸道、消化道等多種途徑侵入人體致病

2、。例如1999年的全國城運會上,51名運動員發(fā)生葡萄球菌腸毒素食物中毒,迫使部分比賽取消,2003年日本發(fā)生的葡萄球菌腸毒素污染牛奶事件,導致14889人中毒。此外SEB是美國已經公布裝備的標準生物戰(zhàn)劑之一,也是生物武器核查單上的失能性戰(zhàn)劑。其沒有傳染性,主要以氣溶膠的形式傳播,而且制備簡單、產量高、穩(wěn)定性好很容易成為生物戰(zhàn)和恐怖分子應用的工具。
　　目的:針對SEB中毒救治,目前國內外主要從兩個方面進行救治藥物研究:一是篩選 S

3、EB拮抗肽類藥物,二是從已上市或即將上市的小分子抗炎癥化學藥物中篩選有效的SEB中毒治療性藥物。這兩類藥物均可以減少細胞因子釋放、減輕休克癥狀,治療SEB的中毒效應。本文擬通過建立體內外篩選模型,以期篩選到療效更好、毒性更低的SEB蛋白類和化學類救治藥物。
　　內容:實驗第一部分首先建立小鼠致死性休克模型,選擇受試小分子化學藥物甲潑尼龍在小鼠致死性休克體內模型中進行保護性實驗,并進行體內外藥效學評價。實驗第二部分對獲贈SEB受體類

4、拮抗劑質粒,選取大腸桿菌進行目的蛋白表達純化,通過ELISA分析該受體拮抗劑與SEB的親合力,此外還對該質粒進行了結構改造,去除組氨酸標簽并在大腸桿菌中表達。第三部分構建SEB受體拮抗劑的重組質粒,選擇畢赤酵母表達系統(tǒng)對目的蛋白進行表達。
　　方法:實驗第一部分建立脂多糖(LPS)增強SEB引起的小鼠中毒性休克模型,給BALb/c雄性小鼠腹腔注射SEB1μg/只4h后,注射 LPS175μg/只,并設置PBS空白組和LPS、SEB

5、對照組,觀察所有小鼠注射SEB后96小時的存活情況,每隔12小時觀察一次。選取甲潑尼龍多個劑量(75mg/kg、50mg/kg、25mg/kg、12.5mg/kg)和不同給藥時間(3.75h、4.25h、4.5h、5h)在該小鼠中毒休克模型中進行劑量-效應關系研究。在小鼠給予 SEB8h后取血,分離血清,通過ELISA方法檢測藥物抑制TNF-α, IL-1α及IFN-γ細胞因子的分泌。用Grahpad軟件統(tǒng)計各組間各細胞因子含量及小鼠生

6、存時間差異。同時進行體外藥效學實驗:
　　1、抑制細胞因子分泌實驗:從健康人外周血中分離PBMC,加受試物共培養(yǎng)16h,ELISA檢測培養(yǎng)上清中TNF-α, IL-1β及IFN-γ等炎癥因子的含量。結果用Graphpad統(tǒng)計組間差異
　　2、抑制人T淋巴細胞增殖實驗:從健康人外周血中分離PBMC,加或不加受試物與SEB共培養(yǎng)72h后,用Luminescent Cell Viability Assay檢測細胞增殖情況,結果用G

7、raphpad統(tǒng)計組間差異。
　　實驗第二部分將獲贈質粒轉入大腸桿菌BL-21(DE3)中對目的蛋白進行表達,將表達產物溶解在8M尿素中進行變性,然后表達產物經過Ni柱親和層析純化,并在純化完成后進行梯度復性,利用ELISA分析目的蛋白與SEB的結合能力,并利用純化的包涵體蛋白制備了SEB受體蛋白的多克隆抗體,此外還對該質粒進行了去除組氨酸標簽的改構。
　　實驗第三部分設計引物,將目的基因片斷進行PCR,與pPIC9k連接,

8、并電轉至畢赤酵母 KM71的感受態(tài)中,挑選陽性轉化子,進行發(fā)酵表達,并對目的蛋白進行Western blot驗證。
　　結果:實驗第一部分在LPS增強SEB引起的小鼠中毒性休克模型中,聯(lián)合給藥組小鼠在12至48小時內出現(xiàn)中毒休克癥狀并在48小時后全部死亡。在甲潑尼龍救治小鼠SEB中毒休克的實驗中,發(fā)現(xiàn)腹腔注射SEB后,注射75mg/kg、50mg/kg、25mg/kg、12 mg/kg甲潑尼龍,其對小鼠的保護率分別為100％、80

9、％、60％、40％與對照組比較存在顯著性差異。腹腔注射SEB后,3.75h、4.25h、4.5h、5h分別注射25mg/kg甲潑尼龍,小鼠的存活率為90％、70％、60％、30％與對照組相比,3.75h、4.25h給藥組有顯著性差異。相比LPS和SEB聯(lián)合注射對照組,甲潑尼龍救治組的中毒小鼠8h血清中的TNF-α、IFN-γ、IL-1α分別被抑制了60％、93％、95％相比對照組有顯著性差異。體外實驗發(fā)現(xiàn)不同濃度的甲潑尼龍與SEB共培養(yǎng)

10、后,40μg/ml、4μg/ml、0.4μg/ml劑量組的PBMC培養(yǎng)上清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β的釋放水平相比SEB對照組,存在顯著性差異。同時,甲潑尼龍能夠抑制SEB引起的T淋巴細胞增殖,400μg/ml、40μg/ml、4μg/ml劑量組與SEB對照組都有顯著性差異。
　　實驗第二部分中,SEB受體拮抗劑成功表達,通過ELISA檢測該蛋白與SEB之間結合能力均可以達到ng/ml,去除組氨酸標簽的SEB受體拮抗劑改

11、構成功,并在大腸桿菌中表達。
　　實驗第三部分中,SEB受體拮抗劑的目的片斷與pPIC9K表達載體構建重組質粒構建成功,蛋白在畢赤酵母 KM71中成功表達,經 Western免疫印跡驗證該蛋白為SEB受體拮抗劑。
　　結論:1、本實驗篩選到甲潑尼龍在小鼠致死性休克體內模型中可對SEB致死起到顯著保護作用,可顯著降低SEB對TNF-α、IFN-γ、IL-1α炎癥因子的誘導作用,體外可顯著抑制人PBMC增殖和人TNF-α、IFN