金黃色葡萄球菌腸毒素B引起THP-1細(xì)胞凋亡的作用與機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是多細(xì)胞生物中重要的生物學(xué)過(guò)程，具有影響組織分化、新陳代謝及免疫調(diào)節(jié)等多方面功能。在細(xì)菌引起的感染性疾病中，細(xì)菌的特定組分可以通過(guò)多種途徑調(diào)控宿主細(xì)胞的凋亡，而這也被證實(shí)對(duì)疾病的進(jìn)程有著至關(guān)重要的影響。
　　金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作為重要的人類病原菌，在其感染過(guò)程中也可引起宿主細(xì)胞凋亡。在許多與金黃色葡萄球菌密切相關(guān)的疾病，如特應(yīng)性皮炎(Atopic Dermat

2、itis，AD)和膿毒癥(sepsis)中，異常的宿主細(xì)胞凋亡現(xiàn)象可顯著影響疾病的進(jìn)程、嚴(yán)重程度和預(yù)后。金黃色葡萄球菌的一個(gè)重要特點(diǎn)是其可分泌多種毒素，包括溶血素、殺白細(xì)胞素、腸毒素及分泌酶等。其中腸毒素是一種重要的金黃色葡萄球菌超抗原，在很多與金黃色葡萄球菌密切相關(guān)的疾病中發(fā)揮著重要的作用。腸毒素的天然受體包括T細(xì)胞受體(TCR)和主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子(major histocompatibility complexⅡ，MHC

3、Ⅱ)，金葡菌腸毒素結(jié)合TCR可持續(xù)激活T細(xì)胞引起超敏反應(yīng);而結(jié)合MHICⅡ則具有促細(xì)胞凋亡作用。在腸毒素家族中，金黃色葡萄球菌腸毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）分布較廣、研究也較為深入。SEB已被證實(shí)能夠引起T細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞(PBMC)凋亡，且這種細(xì)胞凋亡與金黃色葡萄球菌引起的疾病，如AD等密切相關(guān)。但SEB是否能引起單核-巨噬細(xì)胞凋亡，以及其分子機(jī)制目前仍不清楚。
　　本研究從我室

4、分離并完成全基因組測(cè)序的金黃色葡萄球菌XQ株基因組中克隆、表達(dá)并純化了具有生物學(xué)活性的重組SEB蛋白，開(kāi)展了SEB引起THP-1單核-巨噬細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)依賴于TNFα的正反饋回路在此過(guò)程中起到非常重要的作用;同時(shí)發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白2A(metallothionein2A，MT2A)可通過(guò)促進(jìn)SEB引起的TNFα表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)TNFα正反饋回路的形成，在SEB引起THP-1細(xì)胞凋亡的過(guò)程中具有重要地位。所得研究結(jié)果

5、為將來(lái)深入闡明金黃色葡萄球菌腸毒素的作用機(jī)制以及宿主細(xì)胞應(yīng)對(duì)毒素攻擊的機(jī)制提供了重要參考。本論文的主要研究方法和結(jié)果如下：
　　1.重組SEB蛋白的表達(dá)載體構(gòu)建、表達(dá)與純化
　　以金黃色葡萄球菌XQ株全基因組為模板，利用PCR技術(shù)獲得SEB編碼序列，再通過(guò)BamHⅠ+XhoⅠ雙酶切以及采用T4連接酶與表達(dá)載體連接，成功構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pET30a-SEB。將表達(dá)質(zhì)粒pET30a-SEB轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株大腸埃希菌C43后，成功誘導(dǎo)

6、表達(dá)出重組SEB蛋白。
　　表達(dá)的重組SEB蛋白經(jīng)過(guò)鎳柱親和層析純化后，利用去內(nèi)毒素凝膠柱去除內(nèi)毒素、超濾柱濃縮并置換緩沖液為PBS緩沖液，最終以SDS-PAGE測(cè)定重組蛋白純度、Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度及鱟試劑反應(yīng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)殘留內(nèi)毒素，結(jié)果重組SEB蛋白的純度在95％以上，濃度為539.2μg/ml，毒素含量低于2EU/ml，滿足后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)要求。
　　2.重組SEB蛋白具有引起THP-1細(xì)胞凋亡的作用
　　委

7、托北京閱微基因技術(shù)有限公司對(duì)獲贈(zèng)的THP-1細(xì)胞系進(jìn)行STR檢測(cè)，細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)人類細(xì)胞交叉污染，與美國(guó)模式培養(yǎng)物保存中心(American type culturecollection，ATCC)中THP-1細(xì)胞的STR數(shù)據(jù)匹配率為93.33％，證實(shí)我們的細(xì)胞系為THP-1的衍生細(xì)胞系。
　　利用AnnexinⅤ+PI雙染色及流式細(xì)胞分析，確定了重組SEB蛋白具有引起THP-1細(xì)胞凋亡作用，細(xì)胞凋亡比例約為3％，并且具有時(shí)間和劑

8、量依賴效應(yīng)。利用廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK，證實(shí)重組SEB蛋白引起的THP-1細(xì)胞凋亡依賴caspase的級(jí)聯(lián)激活。
　　在IFN-γ激活及PMA誘導(dǎo)分化后的THP-1細(xì)胞中，利用AnnexinⅤ+PI雙染色及流式細(xì)胞分析，檢測(cè)到重組SEB蛋白引起的細(xì)胞凋亡比例更高，分別約為7.5％和15％。內(nèi)毒素激活THP-1細(xì)胞后并不增強(qiáng)重組SEB蛋白引起THP-1細(xì)胞凋亡的作用。然而IFN-γ激活和PMA誘導(dǎo)分化后，陰性對(duì)照

9、組中THP-1細(xì)胞凋亡也有所上升。為避免額外因素的干擾，在接下來(lái)的研究中均直接使用重組SEB蛋白作用于THP-1細(xì)胞而不再進(jìn)行額外的細(xì)胞激活或誘導(dǎo)分化。
　　3.重組SEB蛋白引起THP-1細(xì)胞凋亡依賴于一個(gè)TNFα的正反饋回路
　　經(jīng)典的細(xì)胞凋亡包括外源性（caspase8激活）和內(nèi)源性（caspase9激活）兩條途徑，通過(guò)caspase-3，-8，-9活性檢測(cè)試劑盒對(duì)重組SEB蛋白作用后的TPH-1細(xì)胞之相應(yīng)酶活性檢測(cè)發(fā)

10、現(xiàn)，重組SEB蛋白引起的THP-1細(xì)胞凋亡依賴caspase-3和-8的激活而不依賴caspase-9的激活，說(shuō)明外源性通路在SEB引起THP-1細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　利用RT-qPCR檢測(cè)重組SEB蛋白處理后THP-1細(xì)胞中凋亡相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組SEB蛋白處理后，THP-1細(xì)胞中TNFα和HLA-DRa的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。進(jìn)一步利用ELISA和Western blot實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了重組SEB蛋白在THP-

11、1細(xì)胞中引起的TNFα和HLA-DRa表達(dá)升高。
　　利用anti-TNFα單克隆抗體中和TNFα作用后，檢測(cè)到重組SEB蛋白引起的THP-1細(xì)胞凋亡比例下降至約1％，與重組SEB蛋白直接作用后的3.5％存在顯著差異，而同型對(duì)照抗體則無(wú)此作用，證實(shí)TNFα在SEB引起的THP-1細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　利用siRNA干擾HLA-DRa和TNFR1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在干擾后的THP-1細(xì)胞中，重組SEB蛋白引起的凋亡細(xì)胞比

12、例（約2.5％）顯著低于用無(wú)目標(biāo)siRNA干擾的對(duì)照組細(xì)胞（約9％）。同時(shí)，HLA-DRa和TNFR1siRNA干擾的THP-1細(xì)胞在重組SEB蛋白作用后，TNFα分泌水平也顯著低于無(wú)目標(biāo)siRNA干擾的對(duì)照組細(xì)胞。而TNFα本身又會(huì)上調(diào)HLA-DRa的表達(dá)，從而增加了重組SEB蛋白與HLA-DRa的結(jié)合，使得TNFα的分泌進(jìn)一步增加，于是形成了一個(gè)依賴于TNFα的正反饋回路。重組SEB蛋白引起的THP-1細(xì)胞凋亡依賴于這一正反饋回路的

13、形成和完整。
　　4.MT2A通過(guò)促進(jìn)TNFα的正反饋回路從而促進(jìn)重組SEB蛋白引起的THP-1細(xì)胞凋亡
　　作為SEB的受體，THP-1細(xì)胞的HLA-DRa僅有的胞質(zhì)區(qū)僅含15個(gè)氨基酸殘基，且不含任何已知的結(jié)構(gòu)域，HLA-DRa與SEB結(jié)合后，后續(xù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)很可能依靠與HLA-DRa直接結(jié)合的其他膜蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)。且SEB結(jié)合HLA-DRa以后如何上調(diào)TNFα的表達(dá)機(jī)制也不清楚。利用免疫共沉淀技術(shù)，通過(guò)anti-HLA-DRa

14、單克隆抗體去捕捉與HLA-DRa相互作用的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)金屬硫蛋白(metallothioneins，MTs)MT2A可能參與了SEB引起的THP-1細(xì)胞凋亡作用過(guò)程。
　　利用RT-qPCR分析了THP-1細(xì)胞中MTs的表達(dá)譜及其在重組SEB蛋白作用后轉(zhuǎn)錄水平的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)THP-1細(xì)胞中表達(dá)的MTs包括MT1E、F、G、X和MT2A，在重組SEB蛋白作用后，僅MT2A表達(dá)上升。Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了重組

15、SEB蛋白作用后THP-1細(xì)胞中MT2A的表達(dá)上升約50％。利用AnnexinⅤ+PI雙染色及流式細(xì)胞分析，發(fā)現(xiàn)在siRNA干擾MT2A表達(dá)的THP-1細(xì)胞中，重組SEB蛋白作用后的細(xì)胞凋亡比例（約4％）明顯少于無(wú)目標(biāo)siRNA干擾的對(duì)照組細(xì)胞（約8％）。利用ELISA和Western blot實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步檢測(cè)到在siRNA干擾MT2A表達(dá)的THP-1細(xì)胞中，重組SEB蛋白作用后TNFα和HLA-DRa表達(dá)水平均降低，說(shuō)明MT2A通過(guò)促