金黃色葡萄球菌腸毒素C2His118定點(diǎn)突變研究.pdf

1、超抗原(Superantigen，SAg)是一類具有多種免疫活性的蛋白分子，能大量激活T細(xì)胞。與普通抗原不同，超抗原無需抗原提呈細(xì)胞的加工處理，以完整蛋白形式結(jié)合于MIHCII(MajorhistocompatibilitycomplexclassIImolecules，MHCII)類分子結(jié)合槽的外側(cè)及T細(xì)胞表面TCRVβ(VariablepactsoftheTcellreceptor,TCRVβ)區(qū)。微量超抗原即可產(chǎn)生大量有生物學(xué)活性

2、的細(xì)胞因子和藥性效應(yīng)，引發(fā)超級(jí)抗原依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(Superantigendependcntcell-mediatedcytotoxicity,SDCC)和其它免疫效應(yīng)，從而可在體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞生長。StaphylococcusenterotoxinC2(SEC2)作為由金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的超抗原，在臨床已被用于肺癌、食道癌、卵巢癌、晚期肝癌、大腸癌、血癌、膀胱癌等惡性腫瘤的治療，效果極為顯著。但作為潛在的腸胃毒素，SEC

3、2會(huì)引起嘔吐、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重限制了其在腫瘤治療中的應(yīng)用。 腸毒素分子結(jié)構(gòu)與其致病性、致病能力關(guān)系密切，腸毒素所引發(fā)的催吐效應(yīng)和T細(xì)胞誘導(dǎo)效應(yīng)無關(guān)，而與His118有關(guān)。本研究利用PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)sec2基因中的His118密碼子實(shí)行定點(diǎn)突變，獲得突變體蛋白。通過刺激鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和胰酶穩(wěn)定性研究，分析突變體蛋白的超抗原活性及胰酶穩(wěn)定性。通過對(duì)人大腸癌細(xì)胞CX-1抑瘤研究，確認(rèn)突變體抑瘤效果。本研究結(jié)果如下：

4、 應(yīng)用MutanBESTKit試劑盒，以pET-28a-SEC2為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得SEC2突變體表達(dá)質(zhì)粒：pET-28a-SEC2(H118Y)。SEC2突變基因在大腸桿菌中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。經(jīng)Ni-NTA親和層析柱和SephadexG-75純化，獲得高純度的突變體蛋白。 在胰蛋白酶與突變體蛋白的質(zhì)量比在1:200的條件下，觀察突變體蛋白胰酶穩(wěn)定性。SDS-PAGE結(jié)果表明，突變體蛋白SEC2(H118Y)