超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素C1突變蛋白對百草枯中毒作用的研究.pdf

1、百草枯(paraquat,PQ)是全球廣泛使用的有機(jī)雜環(huán)類接觸性脫葉劑及除草劑,對人畜具有較強(qiáng)毒性,主要表現(xiàn)為肺損傷,且存活人群中絕大多數(shù)患者存在肺間質(zhì)纖維化。現(xiàn)有研究顯示PQ中毒的機(jī)制主要有氧自由基損傷、炎癥因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)作用、對細(xì)胞膜損害等,其中炎癥因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)目前被認(rèn)為與肺纖維化關(guān)系密切。超抗原(Superantigen,Sag)是一類具有超強(qiáng)T細(xì)胞活化功能的蛋白分子,超抗原小劑量時可引起T細(xì)胞的大量活化激活免疫系統(tǒng),而大劑量時引起

2、T細(xì)胞克隆無能和免疫抑制。金黃色葡萄球菌腸毒素C1(staphylococcalenterotoxinC1,SEC1)作為由金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的一種典型超抗原,具有相對低毒的特點(diǎn),并且大劑量應(yīng)用時,可以抑制免疫反應(yīng),使機(jī)體處于免疫不應(yīng)答狀態(tài)。該特點(diǎn)使其有潛力應(yīng)用于百草枯中毒的治療,抑制機(jī)體免疫反應(yīng),進(jìn)而減少全身炎癥反應(yīng)綜合癥(systemicinflammationreactionsyndrome,SIRS)及肺纖維化的發(fā)生。
　

3、　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 利用基因工程技術(shù)對SEC1進(jìn)行定點(diǎn)突變改造,構(gòu)建增活減毒型突變蛋白,并將構(gòu)建的蛋白應(yīng)用于百草枯中毒的小鼠體內(nèi),探討SEC1對百草枯中毒后的全身炎癥反應(yīng)綜合征以及肺間質(zhì)纖維化的影響。證明重組SEC1能夠抑制體內(nèi)炎癥因子的釋放,減少肺組織損傷,下調(diào)纖維化相關(guān)基因mRNA的表達(dá),抑制肺間質(zhì)纖維化。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、SEC1增強(qiáng)減毒型突變體ST-1和ST-2的構(gòu)建
　　 (1)

4、SEC1增活突變蛋白S-1和S-2的構(gòu)建
　　 ①根據(jù)野生型SEC1的cDNA序列使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)突變引物,針對SEC1分子的二硫環(huán)內(nèi)氨基酸進(jìn)行突變研究。②分別應(yīng)用突變引物和端引物擴(kuò)增出突變位點(diǎn)上游和下游的PCR片段,再以上述PCR片段為模板應(yīng)用兩條端引物擴(kuò)增出整條secl突變基因。③將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析④PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的膠回收⑤對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行EcoRI和XhoI雙酶切鑒定⑥構(gòu)建

5、重組表達(dá)載體:將上述經(jīng)雙酶切的突變基因PCR產(chǎn)物與經(jīng)同樣酶切處理的表達(dá)載體pET-28a以1:5濃度混合進(jìn)行10℃過夜連接,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核宿主,篩選陽性克隆的PCR進(jìn)行基因測序。
　　 (2)SEC1減毒突變體ST-1和ST-2的構(gòu)建
　　 ①分別以含有S-1和S-2基因的質(zhì)粒DNA為模板,通過突變引物以重疊PCR法,擴(kuò)增獲得各突變蛋白編碼基因st-1和st-2,經(jīng)Xhol和EcoRI內(nèi)切酶消化后切膠純化,與經(jīng)同樣酶消

6、化的表達(dá)載體pET28a連接過夜,轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)后篩選陽性重組子,經(jīng)測序后驗(yàn)證重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。②將測序結(jié)果正確的突變蛋白表達(dá)宿主菌株進(jìn)行培養(yǎng)后破碎,破碎產(chǎn)物經(jīng)結(jié)合上柱、雜蛋白漂洗和目標(biāo)蛋白洗脫三個步驟處理后得到純化的目標(biāo)蛋白。③分別將純化后的ST-1和ST-2蛋白以SDS-PAGE分離,半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜,以鼠抗His-tag抗體為一抗,堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體為二抗進(jìn)行Westernblottin

7、g分析。
　　 (3)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平的測定
　　 以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液將脾淋巴細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板;經(jīng)過系列10倍稀釋的SEC1、ST-1、ST-2分別加入上述各孔中,通過酶標(biāo)儀以測定波長570nm、參照波長630nm條件下測吸光值。最后以增殖指數(shù)(ProliferationIndex,PI)表示增值能力,PI=實(shí)驗(yàn)組吸光值/陰性對照組吸光值。
　　 (4)ST-1、ST-2致熱

8、毒性和催吐毒性的檢測
　　 2、ST-1對百草枯中毒后全身炎癥反應(yīng)綜合征作用研究
　　 BABL/c小鼠隨分成6組:對照組:PBS溶液以5mL/kg體積濃度腹腔注射小鼠30min后予24mL/kgPBS灌胃;PQ染毒組:PBS溶液以5mL/kg體積濃度腹腔注射小鼠30min后予百草枯240mg/kg灌胃染毒;ST-1組:ST-1溶液以5mg/kg劑量腹腔注射小鼠30min后予24mL/kgPBS灌胃;低劑量ST-1組:S

9、T-1溶液以1mg/kg劑量腹腔注射小鼠30min后予240mg/kg百草枯灌胃;中劑量ST-1組:ST-1溶液以5mg/kg劑量腹腔注射小鼠30min后予百草枯240mg/kg灌胃染毒;高劑量ST-1組:ST-1溶液以10mg/kg劑量腹腔注射小鼠30min后予百草枯240mg/kg灌胃染毒。
　　 觀察小鼠的生存時間。染毒后72h處死小鼠,取血和組織。檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β、IGF-1、PDGF及各組織超微結(jié)構(gòu)變

10、化。
　　 3、ST-1對百草枯中毒致肺間質(zhì)纖維化作用研究
　　 將BABL/c小鼠,隨機(jī)分成6組,分別給予下列處理:對照組(CK組):PBS溶液以5mL/kg體積濃度腹腔注射小鼠30min后予6mL/kgPBS灌胃;PQ染毒組(PQ組):PBS溶液以5mL/kg體積濃度腹腔注射小鼠30min后予百草枯60mg/kg灌胃染毒;ST-1組(ST-1組):ST-1溶液以5mg/kg劑量腹腔注射小鼠30min后予6mL/kgP

11、BS灌胃;低劑量ST-1組(低ST-1組):ST-1溶液以1mg/kg劑量腹腔注射小鼠30min后予60mg/kgPBS灌胃;中劑量ST-1組(中ST-1組):ST-1溶液以5mg/kg劑量腹腔注射小鼠30min后予百草枯60mg/kg灌胃染毒;高劑量ST-1組(高ST-1組):ST-1溶液以10mg/kg劑量腹腔注射小鼠30min后予百草枯60mg/kg灌胃染毒。
　　 觀察小鼠的一般情況,包括體重,攝食量,生存時間。染毒后1

12、周,斷頭法處死小鼠,取肺組織。一部分肺組織行HE染色,觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化。另一部分組織行纖維化相關(guān)基因檢測。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、SEC1免疫增強(qiáng)型突變體ST-1和ST-2的表達(dá)純化
　　 利用定點(diǎn)突變技術(shù)首先將二硫環(huán)內(nèi)部氨基酸102-106(GKVTG)位點(diǎn)突變?yōu)閃WH和WWT,構(gòu)建成突變蛋白S1和S2,以增強(qiáng)其免疫調(diào)節(jié)活性;在此基礎(chǔ)上,將S1和S2的His118和His122位氨基酸突變?yōu)锳la,構(gòu)

13、建成突變蛋白ST-1和ST-2,經(jīng)體外淋巴細(xì)胞增殖測定實(shí)驗(yàn),ST-1、ST-2、SECI濃度在＜100ng/mL時促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖;但當(dāng)濃度＞100ng/mL時能夠抑制淋巴細(xì)胞增殖。且在各個濃度下,ST-1、ST-2的活性與SEC1活性相比有顯著性差異,且ST-1活性大于ST-2(P＜0.05)。
　　 ST-1、ST-2突變蛋白的體內(nèi)致熱毒性通過新西蘭大白兔作為實(shí)驗(yàn)動物模型進(jìn)行檢測。蛋白樣品通過靜脈注射實(shí)驗(yàn)動物,注射劑量為10

14、μg/kg體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在對實(shí)驗(yàn)動物的體溫進(jìn)行監(jiān)測的時間里,陰性對照(PBS)在實(shí)驗(yàn)期間沒引起實(shí)驗(yàn)動物體溫的顯著變化。ST-1、ST-2突變蛋白引起的熱源活性與野生型SEC1相比有顯著提高(圖9,P＜0.01)。
　　 催吐毒性研究中幼齡貓作為動物模型檢測ST-1、ST-2蛋白的催吐腹瀉活性。研究結(jié)果顯示經(jīng)腹腔注射后,在26到48分鐘內(nèi),所有給藥動物都有不同程度的嘔吐和腹瀉反應(yīng)發(fā)生,兩蛋白的毒性強(qiáng)度較野生型SEC1均有一定程

15、度改善,其中ST-2蛋白的腹瀉動物數(shù)最少,而ST-1蛋白的嘔吐動物數(shù)最少,且嘔吐和腹瀉的潛伏期較野生型SEC1和ST-2蛋白滯后。顯示出一定減毒改良效果。
　　 2、ST-1對百草枯中毒后全身炎癥反應(yīng)綜合征的作用
　　 小鼠動物染毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ST-1能夠有效誘導(dǎo)免疫抑制的產(chǎn)生,進(jìn)而降低PQ中毒后血清及組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IGF-1、PDGF的水平,減輕由PQ引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征,減少引起多器官功

16、能損傷甚至衰竭的可能性;ST-1改善肺內(nèi)Ⅱ型上皮細(xì)胞的破壞,減輕細(xì)胞器損傷。
　　 3、ST-1對百草枯中毒致肺間質(zhì)纖維化的作用
　　 中劑量和低劑量的ST-1蛋白拮抗可有效提升因百草枯染毒造成的攝食量下降、體重減輕,提高小鼠存活率。ST-1能夠下調(diào)PQ中毒后α-SMA、Ⅰ型膠原、TGF-β1mRNA水平。小鼠肺組織HE染色提示ST-1能夠減輕肺間質(zhì)纖維化程度。減輕Ⅰ型膠原和肺泡壁的破壞,減少成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo),最終減輕肺

17、間質(zhì)纖維化的發(fā)生。
　　 結(jié)論：
　　 1、本研究中我們構(gòu)建了將二硫環(huán)內(nèi)部氨基酸102-106(GKVTG)位點(diǎn)突變?yōu)閃WH(S1)、WWT(S2),并對其生物學(xué)活性進(jìn)行了研究,突變蛋白的體外刺激T細(xì)胞增殖活性有顯著增強(qiáng)。
　　 2、本研究在二硫環(huán)內(nèi)部氨基酸殘基突變基礎(chǔ)上,將S1、S2的His118和His122突變?yōu)锳la,降低其致熱性性和催吐活性。
　　 3、經(jīng)淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、致熱毒性、催吐活性實(shí)驗(yàn)

18、檢測,ST-1較ST-2增殖活性高,致熱毒性和催吐活性小,因此ST-1被選擇應(yīng)用于后續(xù)的動物研究中。
　　 4、ST-1能夠降低PQ中毒后血清及組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IGF-1、PDGF的水平,減輕由PQ引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征。
　　 5、ST-1能夠改善肺內(nèi)Ⅱ型上皮細(xì)胞的破壞,減輕細(xì)胞器損傷。
　　 6、ST-1能夠中劑量和低劑量的ST-1蛋白可有效提升因百草枯染毒造成的攝食量下降、體重減輕,