金黃色葡萄球菌腸毒素B在枯草桿菌芽孢表面的表達(dá)及免疫特征研究.pdf

1、目的：
　　金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見(jiàn)的病原菌，除引起人類局部化膿感染之外，還能引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至全身感染，如敗血癥、膿毒癥等。近年來(lái)由于抗生素的廣泛應(yīng)用，耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（MRSA）感染日益嚴(yán)峻，大部分MRSA產(chǎn)腸毒素B(SEB)，SEB被認(rèn)為在所有腸毒素中是最具毒性的一種腸毒素，目前臨床上尚無(wú)針對(duì) SEB中毒和感染的有效疫苗和藥物?？莶菅挎擢?dú)特的抗逆性和免疫學(xué)特性，可作為口服疫苗的優(yōu)良載體

2、。本課題擬在枯草桿菌芽孢表面上融合表達(dá) SEB蛋白，使用重組芽孢口服免疫小鼠，觀察其免疫原性，為以SEB枯草芽孢口服疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　SEB在大腸桿菌中的克隆表達(dá)、純化
　　根據(jù)GenBank中SEB的序列，設(shè)計(jì)特異性引物，以臨床分離金葡菌的DNA為模板，PCR擴(kuò)增SEB基因，PCR純化產(chǎn)物和pET-28a(+)質(zhì)粒經(jīng)BamH I、XholI雙酶切后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙

3、酶切，PCR鑒定和基因測(cè)序驗(yàn)證。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化。以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）及免疫印跡法（Western Blot）驗(yàn)證重組蛋白的表達(dá)。
　　SEB基因在枯草芽孢表面的融合表達(dá)
　　以構(gòu)建的 pET-28a(+)-SEB質(zhì)粒為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR純化產(chǎn)物與pUS186-CotC質(zhì)粒經(jīng)Xbal I、Hind III雙酶切后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化枯草桿菌WB600,營(yíng)養(yǎng)

4、枯竭法使用DSM培養(yǎng)基誘導(dǎo)芽孢生成；用SDS-PAGE和Western Blot對(duì)重組芽孢進(jìn)行驗(yàn)證。
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　將18只小鼠分為三組，分別naive，口服CotC芽孢，口服CotC-SEB芽孢，在第0、1、2、16、17、18、28、32、33、34天用灌胃針口服免疫小鼠1×109芽孢，第51天頸椎脫臼法處死小鼠。分別在第-1、15、31、47、50天采集大便、血清。用ELISA方法檢測(cè)大便IgA水平、血清中的IgG

5、1、IgG2a水平。
　　結(jié)果：
　　SEB在大腸桿菌獲得表達(dá)
　　用煮沸法從臨床分離菌獲得PCR模板，PCR擴(kuò)增SEB基因，大小為801bp；重組的pET-28a-SEB基因經(jīng)雙酶切鑒定可見(jiàn)目的片段，測(cè)序結(jié)果顯示SEB起始于ATG，終止于TGA，編碼266個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)SEB蛋白分子量為31556.6Da，等電點(diǎn)為8.65，GRAVY值為-0.655，推測(cè)該蛋白為堿性蛋白和親水性蛋白，同源性比較結(jié)果為99.00％，經(jīng)

6、IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE和Western blot結(jié)果顯示在相應(yīng)分子量35kDa可見(jiàn)重組蛋白。大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白后，在0.25mol/L的KCL溶液中進(jìn)行切膠純化后SDS-PAGE結(jié)果示在35kDa可見(jiàn)明顯條帶。
　　構(gòu)建了重組SEB枯草芽孢
　　以 pET-28a(+)-SEB載體為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，成功擴(kuò)增出約801bp的 DNA片段，重組的pUS186-CotC-SEB經(jīng)雙酶切鑒定

7、可見(jiàn)目的片段，使用 DSM培養(yǎng)基獲得高產(chǎn)量的重組芽孢，產(chǎn)量約為1*1011個(gè)/L，重組芽孢經(jīng)SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證，在相應(yīng)分子量41kDa左右可見(jiàn)目的條帶，與預(yù)期分子量相符。
　　口服重組SEB枯草芽孢誘導(dǎo)小鼠體液免疫
　　使用重組芽胞口服免疫小鼠2周后大便SEB特異性IgA水平明顯升高，并在第47天達(dá)到最高峰，重組芽孢組與非重組芽孢處理組相比有顯著性差異（P<0.001）；血清SEB特異性IgG1、

8、IgG2a水平在第15天明顯升高，其中IgG1水平在第47天達(dá)到最高峰，IgG2a在第51天達(dá)到最高峰，重組芽孢組與非重組芽孢處理組相比有顯著性升高（P<0.05），血清 IgG2a水平升高明顯，提示口服重組SEB芽孢誘導(dǎo)Th1優(yōu)勢(shì)免疫。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建了SEB的原核表達(dá)系統(tǒng)、獲得純化的SEB蛋白，并構(gòu)建表達(dá)SEB重組枯草芽孢，重組芽孢口服免疫小鼠后，可誘導(dǎo)大便SEB特異性IgA，血清特異性IgG1、IgG2a顯著