大鼠心梗模型中管家基因的選擇及ADAMTSs在心梗后心肌中的表達(dá)及機(jī)制.pdf

1、研究背景及目的
　　 基因表達(dá)分析在許多生命科學(xué)研究領(lǐng)域里的重要性日益增加，其研究的深入將為探索疾病相關(guān)基因、了解基因表達(dá)調(diào)控、解析生命奧秘、從而最終為人類服務(wù)大有裨益。反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)是對(duì)特定信使RNA進(jìn)行定量研究的最靈敏方法。為了分析特定信使RNA含量的差別，要用內(nèi)部參照基因來(lái)進(jìn)行定量。管家基因有幾百種，目前，作為內(nèi)參使用最廣泛的管家基因是3磷酸甘油醛脫氫酶、β肌動(dòng)蛋白、18SrRNA和28SrRNA。教條地使用一

2、種管家基因或盲目參照不同實(shí)驗(yàn)對(duì)象及條件所使用的管家基因作為內(nèi)參，一方面可能使基因表達(dá)的微小差異難以發(fā)現(xiàn)，另一方面可能導(dǎo)致錯(cuò)誤甚至相反的結(jié)論。大鼠是一種常用制作心梗模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)于冠心病相關(guān)基因的研究使用大鼠做動(dòng)物模型是許多實(shí)驗(yàn)室的首選。然而，心梗后大鼠內(nèi)參基因選擇問(wèn)題還較少研究報(bào)道。
　　 心肌梗死是威脅人類生命的重大疾病，心肌梗死動(dòng)物模型對(duì)于研究人類冠心病的發(fā)病機(jī)制、病理生理改變以及對(duì)治療方法的評(píng)估都具有重大意義。長(zhǎng)期以來(lái)

3、實(shí)驗(yàn)室研究是用結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈的方法來(lái)制備模型，但在實(shí)踐中，由于麻醉和人工呼吸的使用不當(dāng)、肺損傷以及左冠狀動(dòng)脈定位錯(cuò)誤等各種原因，造成動(dòng)物死亡或制模失敗。因此提高存活率及制模成功率是解決心肌梗死動(dòng)物模型的一個(gè)核心問(wèn)題。我們對(duì)制作大鼠心梗模型的方法加以改進(jìn)，明顯提高了大鼠的存活率，較好地解決了大鼠心梗模型的制備問(wèn)題。
　　 急性心梗是引起人類死亡與殘疾的主要疾病之一。心梗后心室重塑可導(dǎo)致心衰與死亡率的增加。在心室重塑過(guò)程中包括細(xì)胞

4、外基質(zhì)(ECM)分子的集聚和降解的動(dòng)態(tài)變化。許多生物物質(zhì)包括蛋白酶，蛋白酶抑制劑及生長(zhǎng)因子等對(duì)ECM的重建起作用。其中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPS)表達(dá)的增加與激活也牽涉其中。除基質(zhì)金屬蛋白酶外，還有一些蛋白酶家族可降解細(xì)胞外基質(zhì)。ADAMTS是一類分泌性金屬蛋白酶，其主要結(jié)構(gòu)包括解聚素，基質(zhì)金屬蛋白酶和血小板反應(yīng)素基序。在人類中其家族已發(fā)現(xiàn)19個(gè)成員，涉及裂解多種蛋白聚糖，膠原的代謝，抗血管新生，VWF多聚體的降解，以及胚胎器官發(fā)育，生殖

5、等多種功能。其中某些成員可與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合發(fā)揮作用。在頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊及冠脈不穩(wěn)定斑塊中的富巨噬細(xì)胞區(qū)域ADAMTS4與8的表達(dá)增加，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過(guò)程中，ADAMTS4的表達(dá)上調(diào)。Versican是聚集蛋白聚糖家族成員之一，在組織中廣泛存在，參與傷口愈合及組織重塑過(guò)程。在冠脈結(jié)扎致心梗大鼠模型中其在心肌中表達(dá)并短暫升高，提示其參與了心梗后的炎癥反應(yīng)。ADAMTS4降解血管壁里的蛋白多聚糖versican，其作用位點(diǎn)在V1/VOv

6、ersican的Glu1428-Ala1429。ADAMTS4能被內(nèi)源性的抑制劑TIMPs阻斷，ADAMTS4和ADAMTS5均能被TIMP-3有效抑制，而對(duì)TIMP-1，2，4卻基本上不敏感。
　　 近年來(lái)ADAMTS在炎癥及動(dòng)脈粥樣硬化中的作用得到關(guān)注。免疫組化分析示ADAMTS1、4、5、8在人類頸動(dòng)脈病變及冠脈粥樣硬化斑塊處表達(dá)，ADAMTS4、5、8與巨噬細(xì)胞共存而ADAMTS1與內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞共存。Versic

7、an在組織中廣泛分布，亦存在于心臟中。versican在心梗后心臟中表達(dá)增高且其來(lái)源于滲出的單核細(xì)胞，提示其參與心梗后炎癥反應(yīng)。Aggrecan是一個(gè)軟骨特異性的硫酸軟骨素蛋白多聚糖，是ADAMTS的作用底物。ADAMTS4及5表現(xiàn)為較強(qiáng)的降解aggrecan活性。ADAMTS4在心梗后心臟中的具體表達(dá)部位，是否與versican在同一部位表達(dá)以及心梗后是否涉及aggrecan的表達(dá)，目前尚不明確。
　　 在剪切應(yīng)力作用下，人靜

8、脈內(nèi)皮細(xì)胞及心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的ADAMTS1mRNA表達(dá)上調(diào)。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膜及增殖/遷移的主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中，ADAMTS1的mRNA表達(dá)增高。應(yīng)用INF-γ、TNF-α及IL-β刺激巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)INF-γ刺激后ADAMTS4、7、8、9表達(dá)增加，ADAMTS1及17表達(dá)下降，而ADAMTS2、5、10不受其影響，TNF-α刺激后ADAMTS4、7、8表達(dá)增加，ADAMTS9輕微升高，IL-1β刺激對(duì)ADAMTS4、7、8

9、表達(dá)無(wú)影響，而ADAMTSI及9在早期升高，說(shuō)明ADAMTS家族中不同成員表達(dá)及調(diào)控機(jī)制存在差異。
　　 以往研究提示，在動(dòng)脈硬化發(fā)展及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的過(guò)程中，ADAMTS4扮演著重要角色;ADAMTS4可以作為一種預(yù)示斑塊不穩(wěn)定及急性冠脈綜合征嚴(yán)重程度的指標(biāo)。經(jīng)皮冠脈介入治療(PCI)過(guò)程可以看作為機(jī)械擠壓誘導(dǎo)斑塊破裂的模型，因此研究PCI過(guò)程中的炎癥反應(yīng)或許可以為斑塊不穩(wěn)定機(jī)制提供線索。許多臨床研究報(bào)道了冠心病患者P

10、CI后的炎癥反應(yīng)。既然ADAMTS4已被證明是炎癥調(diào)節(jié)酶且與動(dòng)脈硬化的發(fā)展及斑塊不穩(wěn)定相關(guān)，我們猜測(cè)在冠心病患者冠脈循環(huán)中ADAMTS4水平可能升高且受PCI手術(shù)影響。
　　 本研究用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)方法比較了四種管家基因在心梗大鼠心臟中的表達(dá)情況，采用GeNorm算法分析了哪些管家基因最適于心梗后大鼠基因表達(dá)研究。改進(jìn)了大鼠心梗模型的制作方法，提高了手術(shù)成功率及大鼠存活率。探討了ADAMTS4、ADAMTS8、ver

11、sican、TIMP3在大鼠心梗后心臟中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化、分布區(qū)域及可能機(jī)制，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)急性心梗后局部ECM分子的變化及相互作用，為治療提供新的理論依據(jù)。檢測(cè)了IL-1β刺激內(nèi)皮細(xì)胞后ADAMTSs的表達(dá)趨勢(shì)。通過(guò)從冠狀靜脈竇取血檢測(cè)了冠脈ADAMTS4及hs-CRP水平，并評(píng)估了PCI對(duì)ADAMTS4及hs-CRP水平的影響。本學(xué)位論文的主要研究?jī)?nèi)容及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 一、大鼠心梗模型中管家基因的選擇
　　 我們采用

12、結(jié)扎冠脈前降支的方法制作心梗模型，結(jié)合實(shí)際工作，分析并挑選出使用廣泛的4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管家基因:3磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、核糖體蛋白L13A(RPL13A)、β-肌動(dòng)蛋白(ACTB)和結(jié)合區(qū)連接蛋白(ARBP)，用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)方法比較了它們?cè)谛墓４笫笮呐K中的表達(dá)情況，采用GeNorm算法分析哪些管家基因最適于心梗后大鼠基因表達(dá)的研究。結(jié)果示RPL13A、GAPDH、ARBP及ACTB基因的M值分別為0.812、0.721、

13、0.812和1.2，分析得出GAPDH及ARBP是在心梗模型中表達(dá)最穩(wěn)定的基因。
　　 二、大鼠心肌梗死模型制備的改進(jìn)
　　 選取健康雄性Wistar大鼠100只(體重230-270g)，分為模型組(n=80)和假手術(shù)組(n=20)。3％戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉，氣管切開，小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，采用容量控制模式，潮氣量3ml/100g，呼吸頻率60-70次/min，吸呼比1∶1。左側(cè)胸部開胸，由第4肋間入

14、胸，用乳突牽開器牽開肋骨，暴露心臟。在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳之間距主動(dòng)脈根部約3mm處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。觀察心電圖變化，以肢體導(dǎo)聯(lián)2個(gè)以上導(dǎo)聯(lián)ST段抬高，或者肉眼觀察結(jié)扎處下方大面積心肌表面變得蒼白，周圍瘀血征出現(xiàn)，室壁搏動(dòng)減弱為結(jié)扎成功標(biāo)準(zhǔn)。假手術(shù)組大鼠只穿線不結(jié)扎。逐層關(guān)胸，撤除呼吸機(jī)，拔除氣管插管。為防止氣道狹窄及分泌物導(dǎo)致窒息，不縫合氣管及頸部切口。術(shù)中至術(shù)后12h采用40W燈泡照射保暖，術(shù)后4h內(nèi)注意觀察氣管切口處分泌物，及時(shí)

15、用吸痰管清除。結(jié)果示心肌梗死模型制作的成功率為98.6％。模型組術(shù)后3周成活率為88.75％，假手術(shù)組存活率為100％。
　　 通過(guò)對(duì)大鼠心梗模型制作方法的改進(jìn)，提高了手術(shù)成功率及大鼠存活率。
　　 三、大鼠心梗后心肌中ADAMTS4、ADAMTS8、versican、TIMP-3基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化
　　 選擇250-300g雄性Wistar大鼠。按前述方法制作心梗模型，設(shè)假手術(shù)組。分別于手術(shù)后0、3、6、12、

16、24小時(shí)及3、7、14、21天(n=5)過(guò)量麻醉處死大鼠，迅速開胸摘取心臟，將結(jié)扎點(diǎn)下方梗死部位心肌分離切割，放入-70°C冰箱備用。用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法分析梗死心肌中ADAMTS4、ADAMTS8、versican及TIMP-3mRNA表達(dá)，ELISA法檢測(cè)ADAMTS4的蛋白表達(dá)。結(jié)果示ADAMTS4表達(dá)在心梗后6及12小時(shí)明顯升高(p＜0.05)，隨后快速下降。而ADAMTS8則在心梗后6小時(shí)開始升高，至24小時(shí)達(dá)峰值，

17、3天時(shí)仍持續(xù)在高水平(p＜0.05)，然后緩慢下降。心梗后versicanmRNA水平顯著增高，至3天時(shí)達(dá)峰值，且升高持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。TIMP3表達(dá)水平降低。ADAMTS4蛋白水平在心梗后6小時(shí)(p=0.026)、12小時(shí)(p=0.003)、24小時(shí)(p=0.002)及3天(p=0.009)顯著增高。
　　 ADAMTS4、ADAMTS8，versican及TIMP-3在心梗大鼠心臟中表達(dá)，且表現(xiàn)為不同的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。ADAMTS

18、4、versican及TIMP-3的表達(dá)之間存在相互關(guān)系。
　　 四、ADAMTS4在梗死大鼠心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞中表達(dá)
　　 選擇250-300g雄性Wistar大鼠制作心梗模型，設(shè)假手術(shù)組。手術(shù)后3天處死大鼠，取左心室制作冰凍切片。切片厚度為5um。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)ADAMTS4、versican及aggrecan蛋白表達(dá)。對(duì)于陰性對(duì)照組，我們以等比稀釋度用兔IgG處理切片。結(jié)果示ADAMTS4在梗死邊緣區(qū)

19、域心肌細(xì)胞中表達(dá)，在梗死區(qū)域及遠(yuǎn)離梗死區(qū)的正常心肌未見ADAMTS4表達(dá)。在梗死周圍區(qū)域毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞ADAMTS4有弱表達(dá)，versican強(qiáng)表達(dá)。Aggrecan在心梗組及假手術(shù)組的心肌組織及血管內(nèi)膜均未見表達(dá)。
　　 ADAMTS4與versican共同表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞提示二者存在某種聯(lián)系，其動(dòng)態(tài)變化可能在心梗后基質(zhì)重塑中起作用。
　　 五、白介素1β刺激內(nèi)皮細(xì)胞后ADAMTSs的表達(dá)
　　 選取人臍靜脈血

20、管內(nèi)皮細(xì)胞，以傳代培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞。分別以2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml濃度的IL-1β刺激內(nèi)皮細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞提取總RNA及蛋白。用10ng/mlIL-1β刺激內(nèi)皮細(xì)胞，分別于刺激后2h、6h、12h、24h、48h收集細(xì)胞提取總RNA及蛋白，設(shè)空白對(duì)照組，每組5個(gè)樣本。RT-PCR測(cè)定ADAMTS1、4、8、9、15mRNA表達(dá)，Western-blot測(cè)定ADAMTS4蛋白表達(dá)。結(jié)果示IL-1β

21、刺激內(nèi)皮細(xì)胞后ADAMTS1、4、8、9、15mRNA表達(dá)均增高，但隨時(shí)間變化趨勢(shì)不同，ADAMTS4蛋白表達(dá)增高。
　　 此結(jié)果提示ADAMTSs參與炎癥反應(yīng)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。
　　 六、冠心病患者冠脈血中ADAMTS4水平的變化及經(jīng)皮冠脈介入治療對(duì)冠脈ADAMTS4水平的影響
　　 根據(jù)冠脈造影結(jié)果，將81例患者分為對(duì)照組、簡(jiǎn)單病變組及復(fù)雜病變組，其中35例患者接受了PCI治療。血液檢測(cè)標(biāo)本從冠狀靜脈

22、竇獲得。ADAMTS4及hs-CRP值分別通過(guò)ELISA及免疫濁度法檢測(cè)。結(jié)果示復(fù)雜病變組ADAMTS4及hs-CRP值明顯高于對(duì)照組及簡(jiǎn)單病變組(P＜0.001)。所有研究對(duì)象及冠心病患者的ADAMTS4水平均與hs-CRP水平相關(guān)(r1=0.73，r2=0.763，P＜0.01)。接受了PCI治療的患者ADAMTS4值高于未接受PCI者(P＜0.001)，hs-CRP亦表現(xiàn)出相似結(jié)果(P=0.025)。
　　 冠心病患者冠脈