缺氧預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠心梗后心室重構(gòu)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI),導(dǎo)致了心肌細(xì)胞的不可逆的損傷和丟失以及瘢痕的形成,發(fā)生心室重構(gòu)(ventricular remodeling),造成充血性心力衰竭.一致認(rèn)為干細(xì)胞(stem cells)有能力促使組織的再生,修復(fù)受損的心肌,在基礎(chǔ)和臨床的研究中骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem.cells,MSCs)被認(rèn)為能有效的治療心肌梗死. 干細(xì)胞治療心肌梗死,潛

2、在的機(jī)制包括直接再生丟失的心肌細(xì)胞,和心臟組織的其他類型細(xì)胞,但對(duì)此也存在著許多爭(zhēng)論.移植細(xì)胞的低活力限制了有意義的心肌的再生.研究表明通過基因修飾可以增強(qiáng)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用,然而,其安全性和有效性仍然是有爭(zhēng)論的. 以前的報(bào)道表明,缺氧在胎盤的發(fā)育過程中有著及其重要的作用,早期人類胚胎就發(fā)生在一個(gè)非常低的氧濃度的環(huán)境中.MSCs定居的骨髓也是一個(gè)含氧量低的環(huán)境,當(dāng)MSCs的氧濃度減少到5﹪時(shí)增加了它們骨形成的能力,用缺氧刺激MS

3、Cs增加了它們旁分泌的作用. 我們假設(shè)MSCs部分通過旁分泌作用保護(hù)缺血心肌,且對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理可增加保護(hù)缺血心肌的作用,這部分通過增加旁分泌實(shí)現(xiàn).我們?cè)谝浦睬坝萌毖躅A(yù)刺激MSCs,通過在體外和體內(nèi)的研究以進(jìn)一步明確其心臟保護(hù)作用及其機(jī)制. 材料和方法: 體外實(shí)驗(yàn):分別取16-18周齡的雄性SD大鼠的骨髓,體外分離、擴(kuò)增培養(yǎng)MSCs.建立MSCs缺氧模型,留取缺氧3h的MSCs培養(yǎng)基作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用,采用分次消化法

4、分離獲取SD乳鼠的心肌細(xì)胞,以差速貼壁法和Brdu抑制法提純心肌細(xì)胞.十天后,取第一代心肌細(xì)胞進(jìn)入實(shí)驗(yàn),體外實(shí)驗(yàn)時(shí),心肌細(xì)胞隨機(jī)分為四組:分別用MSCs培養(yǎng)基、缺氧預(yù)處理.MSCs培養(yǎng)基(AP-MSCs培養(yǎng)基),DMEM替代標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基,缺氧24小時(shí),對(duì)照組在含20﹪胎牛血清的DMEM中標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)24小時(shí),流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡率. 體內(nèi)實(shí)驗(yàn):成年雄性SD大鼠52只,體重250+30g,分4組,每組13只,培養(yǎng)基DMEM

5、組(G-1)、AP-MSCs培養(yǎng)基組(G-2)、MSCs組(G-3)、AP-MSCs組(G-4).開胸結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支,建立急性心梗模型.一周后再次開胸,G-3組、G-4組將相應(yīng)的5×10<'6>的MSCs、AP-MSCs(150μl濃縮DMEM稀釋)分點(diǎn)注射到大鼠心臟梗死邊緣區(qū);G-1組、G-2組注射等量的濃縮100倍的DMEM、AP-MSCs培養(yǎng)基.一周后,每組處死5只動(dòng)物,取出心臟,左心室按標(biāo)準(zhǔn)的病理技術(shù)切片,行TUNEL染色

6、評(píng)估心肌梗死后凋亡心肌細(xì)胞.蛋白免疫印記檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白BCL-2、BAX.4周后,剩余老鼠采用超聲心動(dòng)圖評(píng)估心功能,處死動(dòng)物,取出心臟,病理切片,行HE染色,改良masson三色染色,測(cè)量膠原含量,進(jìn)行血管計(jì)數(shù). 結(jié)果:體外實(shí)驗(yàn)AP-MSCs培養(yǎng)基能減少缺氧后心肌細(xì)胞的凋亡,但是MSCs培養(yǎng)基不能.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)1、與G1組相比,G2、G3、G4組左室舒張末期和收縮末期內(nèi)徑縮短(G-1:0.75±0.06 vs G-2: 0.63±

7、0.02; G-3:0.57±0.02; G-4:0.49±0.03,p<0.01;G-1:0.60±0.05 vs G-2: 0.40±0.02; G-3:0.36±0.02; G-4:0.28±0.02,p<0.05),短軸縮短率明顯增加,心功能改善.以G4組最為明顯 (G-1:20.94±1.20 vsG-2:36.4±2.39G-3:37.12±2.00 G-4:43.32±1.82, p<0.05.G-4 vs G-2,p<0

8、.05). 2、與G1組相比,G2、G3、G4組心肌細(xì)胞的凋亡明顯減少(G-1:15.09±1.76vs G-2: 8.97±3.21; G-3:11.77±4.05; G-4:7.93±1.47,p<0.05), 尤以G4組最為明顯 (G-4 vs G-3, p<0.05) .上調(diào)了BCL-2的表達(dá). 3、與G1組相比,G2、G3、G4組細(xì)胞外基質(zhì)膠原形成明顯減少(G-1:40.86±4.82vsG-2:32.93±3

9、.15; G-3:33.07±6.95; G-4:27.57±4.14,p<0.05), 以G4組最為明顯 (G-4vs G-2; G-3,p<0.05)血管周圍膠原沉積減少,G4組血管密度上調(diào)(3-4:6.10±0.23 vs G-1:4.88±0.37; G-2:5.13±0.34; G-3:4.78±0.27,p<0.05). 結(jié)論: 1、MSCs移植可以減少心肌細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)血管的生成,減少基質(zhì)膠原形成,延緩心