NKT細(xì)胞在李斯特菌L型感染小鼠模型中的免疫應(yīng)答研究.pdf

1、目的：
　　自然殺傷T細(xì)胞(Natural killer T cells, NKT細(xì)胞)是一類介導(dǎo)先天性免疫和獲得性免疫的免疫細(xì)胞，在抗胞內(nèi)菌的感染中發(fā)揮重要作用，能通過識別APC表面CD1d提呈的糖脂類抗原（脂類抗原為主）而被活化，進(jìn)而發(fā)揮作用。細(xì)菌在體內(nèi)外多種因素的作用下可發(fā)生細(xì)胞壁缺失，變異成為細(xì)菌 L型，導(dǎo)致含有較多脂質(zhì)成分的細(xì)胞膜外露，因此我們推想，與野生型相比細(xì)菌 L型是否能更有效的活化NKT細(xì)胞？目前國內(nèi)外已有許多關(guān)

2、于活化后的NKT細(xì)胞對細(xì)菌的非特異性應(yīng)答和特異性應(yīng)答的研究，但關(guān)于活化后的NKT細(xì)胞對細(xì)菌L型的應(yīng)答研究還很少。因此，我們選用一種兼性胞內(nèi)寄生菌，即產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)，用青霉素誘導(dǎo)其成為L型，并通過尾靜脈注射感染C57BL/6小鼠，分別建立野生型和 L型感染的動物模型，通過檢測感染小鼠肝臟和脾臟中野生型和L型細(xì)菌數(shù)（Colony-Forming Units, CFU）觀察小鼠免疫系

3、統(tǒng)對李斯特菌L型和野生型清除能力的差別；使用流式細(xì)胞儀檢測LM野生型和L型感染小鼠后不同時間點肝、脾中NKT細(xì)胞的活化比例及絕對數(shù)，探討細(xì)菌L型對NKT細(xì)胞的活化與野生型的差別；用酶聯(lián)免疫吸附法測量不同模型中IFN-γ和IL-4在血清中的含量，比較LM及其L型感染小鼠后體內(nèi)細(xì)胞因子分泌量的區(qū)別。
　　方法：
　　1．用青霉素誘導(dǎo)LM成為L型，調(diào)整野生型和L型LM的終濃度為2×105 CFU/ml；2．通過比較幾種分離方法對肝

4、臟淋巴細(xì)胞、NKT、NK細(xì)胞比例和細(xì)胞絕對數(shù)的影響，明確不同肝臟淋巴細(xì)胞分離法的適用范圍；3．分別用PBS、野生型和L型LM0.2ml尾靜脈注射感染C57BL/6小鼠，建立動物感染模型，每組4只；4．感染后第3天無菌分離肝臟和脾臟，檢測各組肝臟和脾臟中LM野生型和L型的CFU；5．感染后第1、3天分別分離小鼠肝臟和脾臟的淋巴細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測各組小鼠肝臟和脾臟淋巴細(xì)胞中 CD3+NK1.1+ NKT、CD3+NK1.1+CD4+

5、NKT、CD3-NK1.1+NK細(xì)胞的比例及絕對數(shù)；6．摘眼球獲取各組小鼠的外周血，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組小鼠血清中IFN-γ和IL-4的含量。
　　結(jié)果：
　　1．經(jīng)過青霉素紙片法誘導(dǎo)獲得L型LM，在L型培養(yǎng)基中形成油煎蛋樣菌落，革蘭染色見部分細(xì)菌由革蘭陽性轉(zhuǎn)變?yōu)楦锾m陰性，呈多形性；細(xì)胞壁染色見細(xì)胞壁缺失所致菌體內(nèi)濃染；
　　2．小鼠肝臟淋巴細(xì)胞分離方法中，肝臟的預(yù)處理會影響淋巴細(xì)胞的獲取率，不放血法獲得的總淋巴

6、細(xì)胞絕對數(shù)、T細(xì)胞比例和絕對數(shù)最高；摘眼球放血結(jié)合體循環(huán)灌流法獲得的總淋巴細(xì)胞比例最高；摘眼球放血法獲得的CD3+NK1.1+ NKT、CD3-NK1.1+NK細(xì)胞比例最高。同時，不同的Percoll分離方法也影響各種淋巴細(xì)胞的獲取，非連續(xù)密度梯度法（33％+70% Percoll）獲得的淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞、CD3+NK1.1+NKT、CD3-NK1.1+NK細(xì)胞比例均高于33%組；
　　3．L型感染組小鼠在感染后第3天肝臟和脾臟的

7、L型CFU數(shù)均明顯低于野生型感染組；
　　4．在感染后的第1天和第3天，比較小鼠肝臟淋巴細(xì)胞中的CD3+NK1.1+NKT、CD3+NK1.1+CD4+NKT、CD3-NK1.1+NK細(xì)胞的比例和絕對數(shù)發(fā)現(xiàn)，L型感染組的上述細(xì)胞均高于野生型感染組；2個感染組的上述細(xì)胞中，除了第1天CD3+NK1.1+CD4+ NKT細(xì)胞的比例外，其它細(xì)胞各項數(shù)值均高于未感染組；其中CD3+NK1.1+NKT、CD3-NK1.1+NK細(xì)胞的比例和絕

8、對數(shù)在第3天較第1天略有下降，野生型和L型感染組CD3+NK1.1+CD4+NKT的絕對數(shù)在第1天和第3天均升高，而第3天較第1天下降，但其比例在L型組中第3天升高，野生型組在第1天下降，第3天升高。
　　5．比較小鼠脾臟內(nèi)CD3+NK1.1+ NKT和CD3-NK1.1+ NK細(xì)胞比例和絕對數(shù)，發(fā)現(xiàn)L型組均高于野生型組，而且2個感染組均高于未感染組，與肝臟中不同的是這2種細(xì)胞的比例和絕對數(shù)在第3天均高于第1天。與未感染組相比，2

9、個感染組小鼠脾臟中CD3+NK1.1+CD4+NKT細(xì)胞的比例在感染后第1天時升高，第3天較未感染組低，但是其絕對數(shù)在第1和第3天均高于未感染組。L型感染組在感染第1天CD3+NK1.1+CD4+ NKT細(xì)胞比例高于，但是在第3天卻低于野生型組，而細(xì)胞絕對數(shù)卻均高于野生型組。
　　6．ELISA檢測感染小鼠外周血分泌的IFN-γ和IL-4的分泌情況，結(jié)果顯示隨著感染時間的增加，血清中 IFN-γ水平不斷增加，且 L型組高于野生型；

10、而隨著感染時間的增加，血清中的IL-4水平先增加后降低，且L型組比野生型組更低。
　　結(jié)論：
　　1．采用摘眼球放血結(jié)合心臟灌流的方法獲得肝臟單個核細(xì)胞懸液，然后采用非連續(xù)密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞，可獲得較大比例的肝臟淋巴細(xì)胞及其亞群。
　　2．在小鼠的肝臟和脾臟中，感染的李斯特菌L型比野生型更容易被清除。
　　3．李斯特菌 L型能更有效的刺激 CD3+NK1.1+ NKT、CD3+NK1.1+CD4+ NKT

11、、CD3-NK1.1+NK細(xì)胞的增殖，這可能是細(xì)菌L型更容易被清除的原因之一。
　　4．肝臟作為固有免疫器官，在抗李斯特菌及其L型感染的非特異性免疫過程中，肝臟中的NKT和NK細(xì)胞在感染早期發(fā)揮作用的高峰比在脾臟更早。
　　5．在抗李斯特菌及其L型感染中，肝臟中活化后的CD3+NK1.1+ NKT細(xì)胞可能以 CD3+NK1.1+CD4+ NKT亞群發(fā)揮主要作用，而脾臟中則以 CD3+NK1.1+CD4-NKT為主。