李斯特菌感染的巨噬細(xì)胞來源的微顆粒在樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的獲得性免疫中的作用.pdf

1、【目的】天然免疫和獲得性免疫之間的相互作用在選擇性清除病原體的過程中發(fā)揮著重要的作用。機(jī)體感染病原菌后天然免疫細(xì)胞首先發(fā)揮作用,當(dāng)天然免疫不能夠徹底清除病菌時(shí),獲得性免疫隨之產(chǎn)生。巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞這兩種關(guān)鍵的免疫細(xì)胞,對(duì)于天然免疫向獲得性免疫的轉(zhuǎn)化至關(guān)重要,然而兩者間的作用機(jī)制尚不清楚。以李斯特菌感染模型為例,機(jī)體產(chǎn)生抗李斯特菌的獲得性免疫反應(yīng)必須需要樹突狀細(xì)胞的參與,單獨(dú)的巨噬細(xì)胞是不能夠誘導(dǎo)出抗李斯特菌特異性免疫的。然而樹突狀細(xì)

2、胞攝取李斯特菌的能力較巨噬細(xì)胞弱很多,這種對(duì)李斯特菌攝取能力的差異提示在細(xì)菌抗原加工、提呈并引起T細(xì)胞保護(hù)性免疫反應(yīng)的過程中,巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞可能承擔(dān)著不同的職責(zé)和作用,了解兩者之間的作用途徑和機(jī)制尤為重要。近年來研究證明,微顆粒在細(xì)胞與細(xì)胞之間信息傳遞過程中發(fā)揮著重要作用,然而其在獲得性免疫過程中的作用尚不清楚。本研究證明了樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的抗李斯特菌特異性免疫過程中巨噬細(xì)胞的重要性,進(jìn)一步驗(yàn)證李斯特菌感染的巨噬細(xì)胞來源的微顆粒在樹

3、突狀細(xì)胞介導(dǎo)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)中的作用,闡述巨噬細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞間相互作用的新途徑。
　　【方法】
　　1.檢測(cè)巨噬細(xì)胞在誘導(dǎo)抗李斯特菌獲得性免疫中的作用
　　(1)清除體內(nèi)巨噬細(xì)胞,檢測(cè)過繼T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
　　選擇16g的雌性裸小鼠腹腔注射30μg抗F4/80的清除抗體,0.8mgClodrolip,或PBS。每組6只,注射體積為200μl,注射時(shí)間在Lm注射前48h和6h。將Lm感染過或未感染的BABL/c小鼠

4、的脾臟T細(xì)胞磁珠分選出來,CFSE染色后通過尾靜脈過繼接種給處理過的裸小鼠,5×106個(gè)T細(xì)胞/只。6h后將1×103個(gè)活Lm經(jīng)尾靜脈注入裸小鼠體內(nèi),60h后取裸小鼠脾臟細(xì)胞流式檢測(cè)過繼T細(xì)胞的增殖情況。
　　(2)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)巨噬細(xì)胞在李斯特菌刺激T細(xì)胞增殖過程中的作用
　　將BABL/c小鼠骨髓來源的DCs與Lm共培養(yǎng),加或不加腹腔巨噬細(xì)胞,培養(yǎng)時(shí)間分別為6h,12h,18h。再與Lm感染小鼠的脾臟T細(xì)胞按1:10共培養(yǎng)

5、,72h后加入3H-胸腺嘧啶脫氧核苷,18h后收集細(xì)胞,液體閃爍儀計(jì)數(shù)。
　　(3)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)李斯特菌感染的巨噬細(xì)胞上清對(duì)T細(xì)胞增殖的影響
　　用Lm感染的巨噬細(xì)胞上清或Lm的培養(yǎng)上清與骨髓來源的DCs共培養(yǎng),6h后再加入Lm感染小鼠的脾臟T細(xì)胞,72h后加入3H-胸腺嘧啶脫氧核苷,18h后收集細(xì)胞,液體閃爍儀計(jì)數(shù)。
　　2.李斯特菌感染的巨噬細(xì)胞釋放的微顆粒的檢測(cè)
　　(1)微顆粒的提取
　　巨噬細(xì)胞與

6、Lm共培養(yǎng)(補(bǔ)加100μg/ml的慶大霉素),培養(yǎng)12h后將上清液經(jīng)過多步離心除去細(xì)胞、細(xì)胞碎片和大部分細(xì)菌,再用1.0μm的濾膜將上清液過濾完全除去Lm,最后用14000g離心60min,獲得微顆粒沉淀。
　　(2)微顆粒的標(biāo)記
　　用經(jīng)過CFSE染色的Lm感染巨噬細(xì)胞,收集上清液中的微顆粒,流式檢測(cè)?；蛘呤菍FSE染色的Lm與PKH-26染色的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng),提取的微顆粒用雙光子共聚焦顯微鏡觀察。
　　3.李斯特

7、菌感染的巨噬細(xì)胞釋放的微顆粒的功能檢測(cè)
　　(1)Lm感染的巨噬細(xì)胞來源的微顆粒刺激DCs活化的檢測(cè)
　　將DCs分別與Lm感染的巨噬細(xì)胞微顆粒,巨噬細(xì)胞微顆粒和PBS共培養(yǎng),24h后分別用抗體CD80、CD86和MHCII的流式抗體染色,流式檢測(cè)表達(dá)情況。分時(shí)間段收取與微顆粒共培養(yǎng)的DCs蛋白樣品,Westernblot檢測(cè)DCs活化信號(hào)ERK和IκB的磷酸化水平。
　　(2)Lm感染的巨噬細(xì)胞來源的微顆粒刺激T細(xì)胞

8、增殖實(shí)驗(yàn)
　　將不同數(shù)量級(jí)的Lm與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng),提取的微顆粒再與DCs共培養(yǎng)后加入Lm感染小鼠的脾臟T細(xì)胞,72h后加入3H-胸腺嘧啶脫氧核苷,18h后收集細(xì)胞,液體閃爍儀計(jì)數(shù)。
　　4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　選擇6-8周齡的BABL/c小鼠,每組6只,用Lm感染的巨噬細(xì)胞微顆粒皮下免疫小鼠,對(duì)照為正常巨噬細(xì)胞微顆粒或Lm培養(yǎng)上清提取物免疫組。連續(xù)免疫7天后尾靜脈注射1×105活的Lm,連續(xù)10天觀察小鼠生存情況。
　

9、　【結(jié)果】
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明巨噬細(xì)胞參與DCs誘導(dǎo)的抗Lm獲得性免疫反應(yīng)
　　清除體內(nèi)巨噬細(xì)胞的裸小鼠過繼接種Lm感染小鼠的CFSE-T細(xì)胞,6h后尾靜脈注射活的Lm,60h后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)清除了巨噬細(xì)胞組的小鼠脾臟中過繼T細(xì)胞不發(fā)生增殖。將Lm感染的巨噬細(xì)胞注射到C57BL/6小鼠腹腔,7天后分離出脾臟細(xì)胞經(jīng)過滅活的Lm再刺激,發(fā)現(xiàn)接種了感染的巨噬細(xì)胞組的脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-22的表達(dá)均顯著升高,同樣流式檢測(cè)

10、CD11c+細(xì)胞IL-12的表達(dá)上調(diào),CD4+細(xì)胞IFN-γ表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果說明誘導(dǎo)抗LmT細(xì)胞免疫反應(yīng)需要巨噬細(xì)胞的參與。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)證明Lm感染的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)DCs成熟并提呈抗原
　　分別用Lm感染的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清,正常巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清和Lm的培養(yǎng)上清來培養(yǎng)DCs,24h后檢測(cè)DCs表面CD80、CD86和MHCII的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Lm感染的巨噬細(xì)胞組DCs這三者表達(dá)均上調(diào),表明DCs被激活。進(jìn)一步通過T細(xì)

11、胞增殖實(shí)驗(yàn)證明,Lm感染的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清具有較強(qiáng)的刺激T細(xì)胞增殖的能力,提示Lm感染的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清含有某種形式的Lm抗原,樹突狀細(xì)胞可以將其攝取并將抗原提呈給T細(xì)胞,誘導(dǎo)獲得性免疫反應(yīng)。
　　3.Lm感染的巨噬細(xì)胞來源的微顆粒刺激DCs活化
　　將Lm感染的巨噬細(xì)胞微顆粒提取出來,利用流式和雙光子共聚焦顯微鏡檢測(cè),可以發(fā)現(xiàn)微顆粒中Lm成分的存在。通過流式檢測(cè)DCs表面CD80、CD86和MHCII的表達(dá),Western

12、Blot檢測(cè)ERK和IκB的磷酸化水平發(fā)現(xiàn)含有Lm成分的微顆?？梢源碳Cs活化并成熟,說明微顆粒將其含有的Lm抗原傳遞給DCs。
　　4.體外實(shí)驗(yàn)證明DCs攝取微顆粒并提呈Lm抗原的機(jī)制
　　將Lm感染的巨噬細(xì)胞微顆粒與DCs共培養(yǎng),檢測(cè)DCs對(duì)微顆粒的攝取發(fā)現(xiàn)約有35％的DCs攝取了微顆粒。與正常情況下巨噬細(xì)胞釋放的微顆粒相比,Lm感染的巨噬細(xì)胞釋放的微顆粒表面Annexin-V表達(dá)更高,這可能是DCs更容易攝取含有Lm

13、成分微顆粒的原因。為了了解DCs是通過何種抗原提呈途徑提呈Lm抗原給T細(xì)胞的,我們用Lm感染MHC-I-/-小鼠巨噬細(xì)胞,提取的微顆粒再與DCs和CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞增殖能力減弱,提示DCs攝取微顆粒中的Lm抗原后可以直接將MHC-I抗原肽復(fù)合物表達(dá)在細(xì)胞表面,提成給CD8+T細(xì)胞。而用MHC-II-/-小鼠的DCs與Lm感染的巨噬細(xì)胞微顆粒共培養(yǎng),檢測(cè)其對(duì)CD4+T細(xì)胞增殖的影響。我們發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞增殖能力顯著降低,這一結(jié)果說

14、明DCs通過攝取微顆粒獲得Lm抗原,加工后組合成MHC-II-/-抗原肽復(fù)合物表達(dá)在細(xì)胞表面,再提成給CD4+T細(xì)胞。上述結(jié)果說明DCs可以通過多種方式攝取微顆粒,包括DCs與微顆粒間的細(xì)胞膜融合方式以及攝取后加工再提呈方式。而進(jìn)一步利用MyD88-/-小鼠實(shí)驗(yàn)證明,DCs攝取Lm-MPs這一過程與TLR信號(hào)通路無關(guān)。
　　5.體外證明含Lm成分微顆粒的產(chǎn)生受到細(xì)胞骨架變化的影響
　　利用F-actin聚合抑制劑和肌球蛋白I

15、I的ATP酶抑制劑作用Lm感染的巨噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)含有Lm成分的微顆粒產(chǎn)量減少。這一結(jié)果提示肌球蛋白II的觸發(fā)和肌動(dòng)蛋白絲產(chǎn)生的張力的變化都對(duì)巨噬細(xì)胞釋放Lm微顆粒具有重要的作用。
　　6.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明李斯特菌感染的巨噬細(xì)胞釋放的微顆粒被DCs攝取
　　將1×107個(gè)CFSE標(biāo)記的Lm注射到小鼠腹腔,12h后沖洗腹腔收集微顆粒,大約有13%的微顆粒含有Lm成分,而這種Lm-MPs主要是由腹腔巨噬細(xì)胞釋放的,因?yàn)榍宄司奘杉?xì)胞后,

16、含Lm成分的微顆粒比例下降到0.6%。將腹腔巨噬細(xì)胞釋放的Lm-MPs再注射到新小鼠腹腔,6h后收集腹腔細(xì)胞染色CD11c,流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)約有3%-6%的細(xì)胞CD11c+,而這些CD11c+細(xì)胞中有40%的細(xì)胞攝取了Lm-MPs。此結(jié)果說明體內(nèi)感染Lm后巨噬細(xì)胞將其吞噬再以Lm-MPs的形式釋放,DCs通過攝取Lm-MPs來獲得Lm的抗原。
　　7.Lm感染的巨噬細(xì)胞來源的微顆?？梢哉T導(dǎo)抗Lm獲得性免疫反應(yīng)
　　分別用巨噬細(xì)胞

17、微顆粒和Lm感染的巨噬細(xì)胞微顆粒皮下免疫小鼠,Lm培養(yǎng)上清按提取微顆粒步驟處理后作為對(duì)照組,7天后尾靜脈注射1×105個(gè)活Lm于小鼠體內(nèi)。觀察各組小鼠成活情況,發(fā)現(xiàn)Lm感染的巨噬細(xì)胞微顆粒免疫的小鼠生存率顯著高于巨噬細(xì)胞微顆粒免疫小鼠和對(duì)照組小鼠。說明李斯特菌感染的巨噬細(xì)胞來源的微顆?？梢哉T導(dǎo)抗李斯特菌保護(hù)性免疫反應(yīng)。
　　【結(jié)論】
　　本研究證明誘導(dǎo)抗李斯特菌獲得性免疫反應(yīng)需要巨噬細(xì)胞的參與。巨噬細(xì)胞吞噬李斯特菌后釋放出含