基于小鼠乳腺癌模型的Tregs細(xì)胞和NKT細(xì)胞在腫瘤免疫作用中的研究.pdf

1、機(jī)體的免疫狀態(tài)與腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系，Burnett和Thomas提出了免疫監(jiān)視學(xué)說認(rèn)為正常機(jī)體的免疫系統(tǒng)通過細(xì)胞免疫機(jī)制識別并特異地殺傷突變細(xì)胞，如果機(jī)體的免疫功能低下、紊亂或受抑制，突變細(xì)胞沒有被清除，就形成腫瘤。腫瘤發(fā)生后，機(jī)體抗腫瘤免疫的機(jī)制包括細(xì)胞免疫和體液免疫兩方面，其中細(xì)胞免疫是抗腫瘤免疫的主要方式。
　　 樹突狀細(xì)胞是腫瘤免疫反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，這足因?yàn)闃渫粻罴?xì)胞(DC)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的專職性抗原遞呈細(xì)胞(AP

2、C)，參與抗原的識別、加工處理與提呈，高表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物(MHC)-Ⅱ類分子、共刺激分子，并分泌高水平輔助性T淋巴細(xì)胞(TH)I型細(xì)胞因子白介素-12,有效地激活T細(xì)胞，引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答。
　　 a-galactosyiceramide(α-GalCer)是一種海綿糖脂，α-Galcer的脂質(zhì)部分與DC細(xì)胞疏水性的CDld抗原區(qū)結(jié)合，糖類部分與NKT細(xì)胞的TCR結(jié)合，因此由CDld呈遞的α-Galcer抗原可以

3、直接或間接激活了NKT細(xì)胞，在體內(nèi)形成NKT細(xì)胞依賴的腫瘤排斥。NKT細(xì)胞足T細(xì)胞的一個特殊的亞群，其表面的TCR可以特異的識別糖脂類抗原并與DC細(xì)胞表面提呈了糖脂配體的CDld分子結(jié)合。NKT細(xì)胞在腫瘤免疫過程中可以發(fā)揮孑然不同的兩種作用:一方面，NKT細(xì)胞被激活后，釋放大量細(xì)胞因子(包括IL-4，IFN-γ)和穿孔素(Pfp)等，殺傷腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮明顯的抗腫瘤效應(yīng)。另一方面，NKT細(xì)胞通過分泌IL-13，抑制CTL介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反

4、應(yīng)，這個過程與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)有關(guān)。Tregs細(xì)胞也是T細(xì)胞的一個特殊的亞群，是一種調(diào)節(jié)性細(xì)胞，是機(jī)體外周耐受的一個重要的組成部分，并且起著抑制腫瘤免疫的作用。通過抗一CD25單克隆抗體剔除Tregs細(xì)胞可以增加腫瘤的免疫監(jiān)視作用和對多種腫瘤的排斥作用。
　　 最近的研究指出Tregs和NKT細(xì)胞能夠相互的影響，并且調(diào)節(jié)其他類型的免疫細(xì)胞。NKT細(xì)胞在腫瘤免疫反應(yīng)中具有兩方面的作用，在某種條件下可能是

5、抑制作用，而在另外一種條件下可能是促進(jìn)作用；用抗-CD25單抗剔除Tregs細(xì)胞后，腫瘤免疫作用足增強(qiáng)的；由α-GalCer激活的NKT細(xì)胞也是促進(jìn)腫瘤免疫的，那么在小鼠乳腺癌的治療過程中聯(lián)合應(yīng)用抗-CD25單抗和α-GalCer治療，是否具有協(xié)同作用?在這種實(shí)驗(yàn)條件下，在Tregs細(xì)胞存在和/或剔除狀態(tài)下，NKT細(xì)胞與Tregs細(xì)胞之間的關(guān)系是怎樣的?這些問題的解決對于更好的了解Tregs細(xì)胞和NKT細(xì)胞在腫瘤免疫中的作用機(jī)制，更好的

6、將Tregs細(xì)胞和NKT細(xì)胞應(yīng)用于臨床，提供理論基礎(chǔ)。
　　 主要的研究內(nèi)容:
　　 1.PC61單克隆抗體的制備:體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水，通過腹水生產(chǎn)抗-CD25單克隆抗體；通過淋巴細(xì)胞活化實(shí)驗(yàn)檢測腹水中抗體活性；用Protein G親和層析的方法純化得到高純度抗-CD25單克隆抗體；最后通過剔除動物體內(nèi)的CD4+CD25+T細(xì)胞來檢測純化抗體的活性。
　　 2.提取小鼠骨髓細(xì)胞，在GM-CSF存在的條件

7、下誘導(dǎo)培養(yǎng)出DC細(xì)胞，DC細(xì)胞先后用α-GalCe和LPS處理，獲得成熟的攜帶有抗原的DC細(xì)胞；
　　 3.利用純化的PC61抗體剔除小鼠體內(nèi)的Tregs細(xì)胞，然后接種腫瘤同時給予處理的mDC細(xì)胞和/或α-GalCer治療組；同時設(shè)立未剔除Tregs細(xì)胞的mDC細(xì)胞和/或α-GalCer治療組
　　 結(jié)果表明:
　　 ①剔除Tregs細(xì)胞小鼠的各治療組(mDC+PC61,α-GaiCer+PC61,mDC+α-G

8、alCer+PC61)的生存時間明顯高于未剔除Tregs細(xì)胞的各治療組(mDC，α-GalCer，mDC+α-GalCer)；
　　 ②剔除Tregs細(xì)胞的α-GaICer治療組、mDC+α-GalCer治療組及單純PC61剔除組小鼠出現(xiàn)腫瘤消退，而未剔除’Fregs細(xì)胞的各治療組(mDC，甜GalCer，mDC+α-GalCer)沒有出現(xiàn)這種現(xiàn)象；
　　 ③剔除 Tregs細(xì)胞的各實(shí)驗(yàn)組(mDC+PC61,α-GalC

9、er+PC61,mDC+α-GalCer+PC61)小鼠的腫瘤生長速度和腫瘤大小明顯低于同期未剔除Tregs細(xì)胞的各治療組(mDC，α-GalCer，mDC+α-GalCer)；
　　 ④剔除。Tregs細(xì)胞的α-GalCer治療組、mDC+α-GalCer治療組及單純PC61治療組的小鼠的肺表面轉(zhuǎn)移腫瘤數(shù)量明顯低于未剔除Tregs細(xì)胞的治療組(mDC，α-GalCer，mDC+α-GalCer)；
　　 ⑤病理學(xué)形態(tài)觀

10、察肝臟，脾臟，肺臟HE染色:對照組和單純給予單抗治療組這兩組的肝臟內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤明顯少于其他各治療組；對照組和各實(shí)驗(yàn)組，肺臟和脾臟內(nèi)均有大量的淋巴細(xì)胞浸潤，沒有明顯的區(qū)別；
　　 ⑥流式結(jié)果檢測:利用小鼠CDld:Ig融合蛋白檢測肝臟，脾臟內(nèi)的NKT。細(xì)胞；單純PC61治療組肝臟和脾臟NKT細(xì)胞與對照組差別不大，其余各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)均高于對照組。在未用單抗治療組，肝臟內(nèi)NKT細(xì)胞數(shù)量與動物牛存率呈現(xiàn)正相關(guān)的趨勢；在加入單抗治療以后，