兔波氏桿菌病診斷方法的研究及fimN基因的原核表達.pdf

1、本論文由四部分組成，一是ELISA檢測方法的建立，二是PCR檢測方法的建立；三是利用PCR技術克隆出支氣管敗血波氏桿菌的fimN基因，四是利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，通過基因重組技術表達出fimN基因，主要試驗和結(jié)果如下： 1．從楊凌隨機采樣50份兔血清，作為待檢血清。用標準菌株(CUCC718)制備的滅活苗免疫家兔，采集血液制備血清作為陽性血清。將臨床健康和菌體凝集抑制試驗陰性兔的剖腹產(chǎn)胎兒的血清作為陰性血清。將標準菌株(CUC

2、C718)制成外膜抗原，通過ELISA酶標抗體和陽性血清最適濃度的選擇、外膜抗原最適濃度的選擇試驗，選用適當?shù)目乖?、抗體、酶標抗體濃度，設立空白孔、陽性孔、陰性孔做待檢血清的ELISA試驗，得出陽性判定值，若待檢血清OD值大于陰性血清的臨界值，則判為陽性，否則判為陰性。用建立的ELISA方法檢測50份兔血清，與菌體凝集抑制試驗得到了相同的結(jié)果，陽性21只，陽性檢出率為42％。 2．根據(jù)GenBank中支氣管敗血波氏桿菌菌毛蛋白基

3、因(fimN)序列設計了一對引物，擴增出大小為648bp的目的基因片段，建立了快速檢測兔支氣管敗血波氏桿菌的PCR方法。特異性和敏感性試驗表明，該方法對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和巴氏桿菌均無交叉性反應。用該PCR法檢測了從楊凌采集的50份表現(xiàn)臨床癥狀的兔呼吸道分泌物檢出支氣管敗血波氏桿菌陽性35例，陽性率為70％。同時與傳統(tǒng)的細菌檢查法、微量凝集法進行了比較，結(jié)果顯示，該PCR法的檢出率是細菌檢查法的3．89倍，是微量凝集法的1．94倍

4、。 3．將PCR產(chǎn)物648bp的基因片段克隆至pMD-19T Vector中，用EcoR Ⅰ、HindⅢ進行雙酶切，獲得目的條帶，陽性質(zhì)粒測序后與GenBank中的序列進行比較，同源性達99％，成功的構建了克隆載體pMD19T-fim N。 4．用EcoR Ⅰ和HindⅢ雙酶切pMD19T-fimN以及表達載體pET-32a(+)，純化回收后連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細菌，獲得重組質(zhì)粒pETBb-fimN。酶切和序列分析