兔支氣管敗血波氏桿菌檢測方法的建立及應用.pdf

1、支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)是一種重要的病原菌，廣泛感染包括豬、犬等家畜，兔、豚鼠等實驗動物，雪貂、考拉熊及栗鼠等野生動物在內(nèi)的多種哺乳動物，并造成急慢性的呼吸道疾病。人也有感染該菌的報道，尤其是小孩和免疫力缺陷的人群。近年來，隨著我國規(guī)?；B(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展，支氣管敗血波氏桿菌感染明顯增加，并常與多殺性巴氏桿菌、葡萄球菌等混合感染，已成為兔業(yè)養(yǎng)殖中發(fā)病率和死亡率增加的重要原因之一，給養(yǎng)兔業(yè)造

2、成重大的經(jīng)濟損失。 本研究由三部分組成，一是OMP-ELISA抗體檢測方法的建立及應用；二是針對支氣管敗血波氏桿菌的菌毛蛋白建立并比較了三種抗體檢測方法；三是PCR檢測方法的建立及應用。 主要試驗和結果如下： 1.應用超聲波裂解結合超速離心法提取支氣管敗血波氏桿菌外膜蛋白(OMP)，包被酶標板，建立了檢測兔波氏桿菌病抗體的間接ELISA方法。試驗確定抗原的包被濃度為14.44μg/mL，檢測血清作1：400稀釋，

3、以及間接ELISA的最佳反應條件。該方法有很高的特異性和重復性，與微量凝集試驗相比，符合率為87.56％，敏感性提高約33倍。該ELISA方法不僅敏感、特異、快速、簡便，而且經(jīng)濟、易于重復，適于推廣應用。 2.利用超聲波處理結合TritonX-100溶解法制備粗提的菌毛抗原，建立了三種用于支氣管敗血波氏桿菌的抗體檢測方法：瓊脂免疫擴散試驗(AGID)、玻片凝集試驗(SAT)、間接血凝試驗(IHA)。臨床檢測了458份兔血清樣品，

4、結果發(fā)現(xiàn)，IHA試驗的陽性檢出率最高(73.36％)，其次為AGID( 63.54％)和SAT試驗(61.79％)；IHA與AGID的符合率為90.17％，與SAT試驗的符合率為86.68％，AGID與SAT的符合率為89.08％。IHA更為敏感，且與AGID有較好的符合率，可用于支氣管敗血波氏桿菌的血清學監(jiān)測。 3.根據(jù)GenBank中支氣管敗血波氏桿菌菌毛蛋白基因(fim2)序列設計了一對引物，擴增出大小為425bp的目的基

5、因片段，建立了快速檢測兔支氣管敗血波氏桿菌的PCR方法。該產(chǎn)物序列與GeneBank上公布的基因序列同源性為100％。特異性和敏感性試驗表明，該方法對大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、魏氏梭菌和金黃色葡萄球菌均無交叉性反應，并且最小可檢出菌液濃度為3.6CFU。用該PCR方法檢測了從江蘇、山東等地采集的146份兔鼻拭子，結果檢出支氣管敗血波氏桿菌陽性92例，陽性率為63.01％。 本試驗應用超聲波裂解結合超速離心法制備了Bb的外膜蛋白，