兔支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定及其外膜蛋白免疫效果的研究.pdf

1、兔支氣管敗血波氏桿菌病是由支氣管敗血波氏桿菌引起的一種常見(jiàn)兔呼吸道疾病。主要引起哺乳仔兔和斷乳仔兔的急性死亡，成年兔的鼻炎、支氣管炎和膿皰性肺炎等，對(duì)養(yǎng)兔業(yè)造成很大的危害。2006年以來(lái)，山東省某一大型兔場(chǎng)(飼養(yǎng)新西蘭肉種兔2400余只)，所產(chǎn)仔兔(共計(jì)465只)，均在20～30日齡發(fā)病，表現(xiàn)為精神不振，多數(shù)病兔鼻腔流出膿性鼻液，周圍的被毛沾有粘液膿性分泌物，后期出現(xiàn)結(jié)痂，隨著病程的延長(zhǎng)，逐漸表現(xiàn)為呼吸困難，并出現(xiàn)鼻鼾聲，體況瘦弱，下痢

2、拉稀。為了進(jìn)一步探討引起該規(guī)?；脠?chǎng)呼吸道疾病的原因，本研究通過(guò)病原學(xué)檢查，對(duì)主要病原進(jìn)行了分離鑒定和分子生物學(xué)特性的研究，同時(shí)對(duì)分離到主要病原菌的外膜蛋白提取后進(jìn)行了免疫原性研究，為規(guī)?；N兔場(chǎng)呼吸道疾病的防治提供了理論依據(jù)。 本研究共分2部分： 一、兔支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定及其分子生物學(xué)特性的檢測(cè)2006年，山東省某一大型養(yǎng)兔場(chǎng)的20～30日齡的幼兔突然大批發(fā)病死亡。病兔早期精神不振，多數(shù)病兔鼻腔流出膿性鼻液，

3、隨著病程的延長(zhǎng)逐漸表現(xiàn)為呼吸困難，并出現(xiàn)鼻鼾聲，以體況瘦弱，下痢拉稀為主要癥狀。從中主要分離到4株細(xì)菌，根據(jù)其形態(tài)學(xué)特性、培養(yǎng)特性、生化特性、血清學(xué)反應(yīng)特性等可將分離菌鑒定為兔支氣管敗血波氏桿菌。然后對(duì)所分離到的兔支氣管敗血波氏桿菌P13菌株進(jìn)行(G+C)mol％含量的測(cè)定以及16SrRNA的擴(kuò)增，結(jié)果(G+C)mol％含量為61.7～62.4％，與KerstersK結(jié)果相符(61.6～62.6％)；而該菌16SrRNA核苷酸序列與Ge

4、nbank中收錄的AF177666株禽波氏桿菌菌株核苷酸序列同源性為82.7％，與本實(shí)驗(yàn)室保存的兔支氣管敗血波氏桿菌菌株P(guān)11菌株及參考菌株同源性高，分別為99.7％和99.9％。最后利用所分離到的兔支氣管敗血波氏桿菌菌株制備免疫原，通過(guò)免疫仔兔，使仔兔獲得抗體，而使幼仔兔獲得保護(hù)，并且效果較好。 二、兔支氣管敗血波氏桿菌外膜蛋白的提取及其免疫效果的檢測(cè)本研究以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，研究支氣管敗血波氏桿菌的外膜蛋白(OMP)和其中

5、的有效保護(hù)抗原成分(OMP68)的免疫原性及免疫保護(hù)作用。本研究利用改進(jìn)的Wooldridge的方法提取了支氣管敗血波氏桿菌P11和P13的OMP，利用SDS-PAGE電泳比較了兩株之間差異，采用Western-blotting進(jìn)行了分析并確定了P13菌株OMP(P13-OMP)中的有效保護(hù)性抗原成分，采用電洗脫方法獲得分子量為68KD的P13-OMP中的有效保護(hù)抗原成分(OMP68)，然后制備了油乳劑P13的全菌、P13-OMP和OM

6、P68免疫抗原。抗體動(dòng)態(tài)變化：將清潔級(jí)小鼠70只隨機(jī)分成7組，10只/組，用油乳劑P13的全菌和不同劑量的P13-OMP和OMP68免疫抗原分別免疫，采用間接ELISA檢測(cè)免疫小鼠的相應(yīng)抗體水平并分析抗體動(dòng)態(tài)變化；主動(dòng)免疫保護(hù)試驗(yàn)：將清潔級(jí)小鼠80只隨機(jī)分成8組，10只/組，分別采用制備的油乳劑P13-OMP(OMP25μg/只)、OMP68(25μg/只)和P13菌體免疫抗原在免疫10d后，分別用100LD50的P11和P13腹腔攻毒

7、，然后統(tǒng)計(jì)保護(hù)率并分析免疫原所提供的免疫保護(hù)力。免疫P13-OMP和OMP68油乳劑抗原后，7d時(shí)，抗體水平開(kāi)始逐漸上升，42d時(shí)，抗體水平分別達(dá)到215.3和214.8，然后逐漸下降，70d時(shí)，抗體水平分別達(dá)到29.1和210.2。主動(dòng)免疫時(shí)，P11和P13攻毒的P13-OMP免疫組分別均得到9/10和9/10的保護(hù)，OMP68免疫組分別均得到9/10和10/10的保護(hù)，而P13全菌免疫組分別得到4/10和6/10保護(hù)，對(duì)照組全部死亡