豬D型多殺性巴氏桿菌毒素分段基因的原核表達及表達重組蛋白免疫學特異性的初步研究.pdf

1、產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌（T?Pm,Toxigenic Pasteurella multocida）是引起豬進行性萎縮性鼻炎（PAR,Progressive atrophic rhinitis）重要致病因子，PAR作為一種進行性的呼吸道疾病，在臨床上會引起育肥豬生長緩慢，降低飼料報酬，使養(yǎng)豬業(yè)蒙受巨大的經(jīng)濟損失。臨床癥狀主要表現(xiàn)為：鼻甲骨萎縮、顏面變形、持續(xù)性打噴嚏。多殺性巴氏桿菌毒素（PMT,Pasteurellamultocida to

2、xin）是由片段為3858bp的ToxA基因編碼大小為146kDa的壞死性毒素蛋白，它是PAR主要的保護性抗原之一。因此本課題通過分子生物學的方法對PMT進行分段研究得到分段重組蛋白，并對其生物學生性及免疫學特性進行初步研究，為AR的診斷及防制的進一步研究提供技術支持。
　　 本課題參照GenBank上毒素多殺性巴氏桿菌toxA基因序列AF240778，先設計1對引物，從本實驗室分離鑒定的豬源D型產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌中擴增出to

3、xA編碼區(qū)3858bp的片段，再根據(jù)toxA基因序列設計3對分段引物，即通過PCR方法將產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌的毒素基因進行分段PCR擴增，得到3個基因片段分別為1084bp（ZQ）、1092bp（ZH）、906bp（HM），將3個基因片段轉(zhuǎn)化到克隆載體PMD-18T上進行克隆，挑斑后進行酶切鑒定為陽性質(zhì)粒后進行測序，測序結(jié)果正確，證明克隆載體構(gòu)建成功，得到3個正確的克隆質(zhì)粒PMD-ZQ、PMD-ZH、PMD-HM。再利用轉(zhuǎn)化方法將克隆質(zhì)

4、粒轉(zhuǎn)化到表達載體pET32a上，酶切鑒定為陽性質(zhì)粒后進行測序，測序結(jié)果正確，證明表達載體構(gòu)建成功，得到3個正確的表達載體質(zhì)粒PET-ZQ、PET-ZH、PET-HM。
　　 表達載體構(gòu)建成功后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）PlysS中通過IPTG誘導后進行SDS-PAGE驗證，得知毒素基因里只有片段ZQ、HM得到表達，大小分別為75 kDa（ZQ）、50kDa（HM），ZH不表達。通過Westem blot方法檢測ZQ、HM兩個

5、重組蛋白，只有HM重組蛋白得到了正確表達，且有很好的反應原性。后期通過Dot-ELISA、小鼠接毒實驗等特異性實驗，對該重組蛋白的生物學特性及免疫學特性進行了初步研究。結(jié)果表明，表達重組蛋白HM具有一定的生物學活性及反應原性和免疫原性；與天然蛋白比較，重組蛋白具有較高的特異性。該研究為多殺性巴氏桿菌毒素的生物學特性、蛋白功能性結(jié)構(gòu)域及抗原表位的進一步研究奠定了基礎，進而為豬傳染性萎縮性鼻炎的診斷、檢測和防疫工作提供了理論指導和技術支持，