瘧原蟲傳播阻斷疫苗候選抗原P48的構(gòu)建及其效應(yīng)機制的研究.pdf

1、實驗?zāi)康模?br>　　 瘧疾給人類帶來的嚴重健康危害和社會經(jīng)濟負擔已經(jīng)推動了全球瘧疾行動計劃的發(fā)展,世界衛(wèi)生組織再次把對瘧疾的消滅工作納入到議事日程中。實現(xiàn)這個宏偉目標所面臨的最大挑戰(zhàn)就是干預(yù)瘧疾在全球的傳播,而阻斷瘧疾傳播的疫苗無疑是最為理想的手段。傳播阻斷疫苗(TBV)的原理是以有性階段蟲體特異表達的表面靶蛋白作為抗原免疫人體,使之產(chǎn)生抗有性階段蟲體表面蛋白的特異性抗體,從而導(dǎo)致有性階段瘧原蟲的進一步發(fā)育障礙,阻斷瘧原蟲的傳播。從

2、群體角度出發(fā),個體接種TBV后,受益的將是整個流行區(qū)內(nèi)的人群。惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲在全球流行最為廣泛,世界上大約40%的人口生活在間日瘧流行區(qū),每年導(dǎo)致1.3億人的感染。惡性瘧和間日瘧流行區(qū)的臨床資料表明:問同瘧的傳播更難以控制,其重要的原因就是間日瘧配子體在患者出現(xiàn)臨床癥狀前已經(jīng)出現(xiàn)在外周血液中,提示患者在治療前就已經(jīng)能夠傳播瘧疾,因此對于控制間日瘧來說,有效的TBV的研制開發(fā)尤為重要。
　　 配子體是患者外周血液中所存在的

3、瘧原蟲有性階段的開始,能夠隨著血液被蚊子吸食到其體內(nèi),然后雌雄配子體在蚊胃內(nèi)繼續(xù)發(fā)育,成為雌雄配子;后者經(jīng)受精形成合子,合子變長,能動成為動合子。動合子穿過胃壁上皮細胞或其間隙,在蚊胃基底膜下形成圓球形的卵囊。卵囊進行孢子增殖,形成數(shù)以萬計的子孢子。子孢子隨卵囊破裂釋出或由囊壁鉆出,經(jīng)血淋巴集中于按蚊的唾液腺,當受染蚊再吸血時,子孢子即可隨唾液進入人體,造成瘧疾的傳播。大量的研究已經(jīng)表明,不論是自然感染,還是注射疫苗,所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體隨

4、著蚊子吸血進入到蚊體內(nèi),均能抑制瘧原蟲在蚊胃內(nèi)的發(fā)育,從而阻止原蟲完成生活史。目前最令人關(guān)注的傳播阻斷候選抗原包括表達在配子體表面的受精前抗原P48/45和P230,及表達在合子、動合子表面的受精后抗原P25和P28。到目前為止,只有Pfs25和Pvs25已經(jīng)進入人體臨床試驗階段。而關(guān)于間日瘧原蟲相關(guān)抗原的研究相對滯后,目前只有Pvs25和Pvs28研究的相關(guān)報道。P48/45蛋白是表達于瘧原蟲有性階段配子體和配子表面的主要蛋白,其在雄

5、配子的受精過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用,P48/45基因突變的雄配子在粘附和鉆入雌配子時受到強烈抑制,動合子的形成數(shù)量明顯減少。特異性單克隆抗體結(jié)合。P48/45構(gòu)象表位后,同樣能夠抑制雄配子的受精而發(fā)揮傳播阻斷作用。P25是瘧原蟲蚊發(fā)育階段合子和動合子表面表達的主要蛋白,對識別蚊胃表面受體,穿過蚊胃上皮細胞及囊合子的形成具有重要的作用。并且,前期我們對我國間日瘧原蟲單一和混合流行區(qū)分離株P(guān)vsP48/45全長基因及Pvs25基因進行了克隆和

6、序列分析,實驗結(jié)果顯示,我國間日瘧原蟲中低密度單一流行區(qū)和高發(fā)的混合流行區(qū)分離株P(guān)vs48和Pvs25基因均具有高度的保守性。以上結(jié)果表明,P48/45和P25作為傳播阻斷候選抗原均具有明顯的優(yōu)勢和可行性。
　　 目前Debabani等已在大腸桿菌中表達出具有良好免疫原性的全長重組Pfs48/45,通過膜飼實驗顯示其抗體具有明顯的傳播阻斷活性。但關(guān)于間日瘧原蟲Pvs48蛋白的表達,還未見報道。本研究通過對間日瘧原蟲P48抗原,進

7、行基因密碼子優(yōu)化,體外合成基因,構(gòu)建原核表達載體,嘗試體外原核表達重組蛋白Pvs48(rPvs48),并對表達的蛋白進行了免疫活性檢測,旨在為有效抗間日瘧原蟲傳播阻斷疫苗的研制開發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。
　　 目前尚不能對間日瘧原蟲進行體外培養(yǎng),這一事實在很大程度上制約了人們對間日瘧原蟲進行更為深入地研究,而鼠瘧恰好為人類瘧原蟲的研究提供了良好的動物模型。重組蛋白的免疫原性依賴于抗原表位結(jié)構(gòu)的正確折疊,佐劑的使用及多重免疫,然而核

8、酸疫苗能夠滿足這些需求。核酸疫苗可以在宿主體內(nèi)表達具有構(gòu)象結(jié)構(gòu)的抗原,既能誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答,又能誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答。我們前期已經(jīng)構(gòu)建了約氏瘧原蟲Pys48核酸疫苗(DV/Pys4.8),并對其免疫活性進行了初步探討。在此,本研究進一步利用成功構(gòu)建的DV/Pys48免疫BALB/c小鼠,對機體免疫功能特點進行了研究,探討P48蛋白作用于機體的免疫應(yīng)答機制,并且通過再感染約氏瘧原蟲,進一步探討其傳播阻斷效應(yīng),以期為有效瘧疾疫苗的研制開發(fā)提供新

9、的理論依據(jù)。
　　 實驗方法：
　　 1、PVs48基因合成及原核表達載體構(gòu)建
　　 根據(jù)SalⅠ基因(GeneBank#XM_001614196)和E.coli表達系統(tǒng),對目標基因的密碼子序列進行優(yōu)化設(shè)計和合成,兩端插入XbaⅠ和XhoⅠ的酶切位點,擴增并抽提含有目標基因Pvs48的載體質(zhì)粒,將目標基因亞克隆到Ecoli表達載體pET30a上,測序驗證構(gòu)建重組表達質(zhì)粒的準確性。
　　 2、rPvs48的

10、表達及純化
　　 擴增并抽提構(gòu)建好的表達質(zhì)粒,將表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到高效的E.coli表達菌株BL-21中。至少挑選5個陽性克隆于LB培養(yǎng)基中,擴增并誘導(dǎo)表達目標蛋白。SDS-PAGE電泳檢測目標蛋白的表達情況,并挑選合適的單克隆菌株用于目標蛋白的制備。37℃搖瓶培養(yǎng)1L重組細菌,待OD600大約1.0時,加入1mMIPTG誘導(dǎo)表達目標蛋白。對表達產(chǎn)物先增溶后,再通過親和,離子交換,疏水及凝膠過濾等多種層析方法純化表達的重組蛋白。對洗

11、脫樣品及透析后的產(chǎn)品用抗His單克隆抗體進行Westernblot檢測,最終蛋白產(chǎn)品通過0.22μm濾膜過濾除菌,采用Bradford法檢測蛋白產(chǎn)品濃度。
　　 3、實驗動物免疫及血清采集
　　 (1)rPvs48免疫:將6～8w雌性BALB/c小鼠隨機分成2組,每組5只。第一組為rPvs48免疫組,第二組為單純佐劑對照組。第一組將300μl含有50μgrPvs48的緩沖液與300μl完全弗氏佐劑充分乳化后,進行腹腔內(nèi)注

12、射免疫。分別于初次免疫后3w和6w,以等量重組蛋白加不完全弗氏佐劑進行2次加強免疫。第二組對照組初次只用300μl完全弗氏佐劑免疫,分別于初次免疫后3w和6w,再用300μl不完全弗氏佐劑加強免疫。于免疫前3天及免疫后2w、5w、8w進行小鼠尾尖采血(100μl/次),收集免疫血清待測。
　　 (2)DV/Pys48免疫:無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取DV/Pys48質(zhì)粒。將含有50μgDV/Pys48的PBS緩沖液100μl接種于

13、6～8w雌性BALB/c小鼠的皮下肌肉內(nèi),對照組注射100μl含有50μg空質(zhì)粒,分別于初次免疫后3w和6w,以等量質(zhì)粒進行2次加強免疫。并于每次免疫前1～3d尾尖采集小鼠血液,分離血清,-20℃凍存。最后一次免疫3w后,將鼠隨機分成兩組,一組經(jīng)腹腔感染1×106Py17XL,寄生的紅細胞;另一組小鼠處死后用于免疫指標的檢測。
　　 4、Py17XL配子體分離
　　 Py17XL感染BALB/c小鼠,待感染率達40～50

14、%(配子體率5%左右),乙醚麻醉,心臟采血,經(jīng)CF11纖維素柱去除白細胞,45%的Percoll密度梯度離心分離,室溫350g離心20min,收集中間灰白層配子體,PBS清洗2次,取10μl涂布在玻片,Giemsa染色,光鏡下計數(shù)配子體含量,剩余配子體經(jīng)0.01%皂甙-PBS裂解紅細胞膜,-80℃凍存。
　　 5、ELISA檢測血清特異性抗體
　　 (1)rPvs48免疫:用溶解在碳酸鹽緩沖液的rPvS48(6μg/ml

15、)包被96孔酶標板。
　　 (2)DV/Pys48免疫:用溶解在碳酸鹽緩沖液的配子體抗原(5μg/ml)包被96孔酶標板。
　　 4℃過夜,用含1%BSA的PBS封閉1h,以PBS緩沖液連續(xù)倍比稀釋免疫后不同時間的小鼠血清,每孔100μl,37℃孵育2h,PBST清洗,加入1:5000倍稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG,孵育1h,PBST清洗,加入底物鄰苯二胺和過氧化氫進行顯色,酶標儀檢測492nm處OD值。結(jié)果判定:以吸

16、光度大于陰性對照均值+3S.D作為陽性反應(yīng)的標準?？贵w效價為實驗組和陰性對照組光吸收比值≥2.1時的最大稀釋倍數(shù)。
　　 6、間接免疫熒光試驗
　　 將間日瘧原蟲感染的外周血涂布熒光片,冷丙酮固定10min。用含5%脫脂奶粉的PBS37℃封閉30min,加入1:10稀釋抗血清,37℃孵育60min,在FITC標記的羊抗鼠IgG血清中反應(yīng)60mm,DAPI染色5min,封片,熒光顯微鏡觀察。
　　 7、核酸疫苗免疫

17、小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中細胞因子的檢測
　　 常規(guī)無菌取三次疫苗免疫后小鼠的脾臟,制備濃度為1×107/ml脾細胞懸液,于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)48h后,收集培養(yǎng)上清,用雙抗體夾心ELISA試劑盒分別檢測IFN-γ和IL-4產(chǎn)生水平。酶標儀測定450nm處的0D值,結(jié)果以試劑盒提供的標準品繪制標準曲線,應(yīng)用SoftMaxPro4.3.1LS軟件分析,計算細胞因子含量。
　　 8、核酸疫苗免疫小鼠脾細胞樣品熒光抗體染色
　　

18、 常規(guī)方法制備脾細胞懸液,用0.17mol/LNH4Cl裂解紅細胞。用含10%胎牛血清的RPMI1640調(diào)整脾細胞終濃度為1×107/ml。
　　 (1)樹突細胞亞群檢測:每份樣品用抗CD11c-FTTC單抗、抗CD11b-PE單抗和抗CD45R/B220-PerCP單抗進行三色分析,另設(shè)陰性對照管。在預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1ml,再加入抗CD11c-FITC單抗、抗CD11b-

19、PE單抗和抗CD45R/B220-PerCP單抗進行表面染色,離心去上清后,用0.5mlPBS重懸浮細胞,流式細胞儀進行檢測。
　　 (2)樹突細胞胞內(nèi)TLR9表達水平:每份樣品用CD11c-FITC單抗進行染色,用固定液固定,專用透膜液透膜后,加入生物素標記的TLR9單抗孵育后,再加入PE標記的親和素,另設(shè)陰性對照管。避光孵育15min,離心去上清后,用0.5mlPBS重懸細胞,流式細胞儀進行檢測。
　　 (3)脾細胞

20、中分泌IgG抗體的B細胞數(shù)量:每份樣品用CD45R/B220-PerCP單抗和抗IgG-FITC抗體進行雙色染色,另設(shè)陰性對照管和各單標管。避光孵育15min,離心去上清后,用0.5mIPBS重懸細胞,流式細胞儀進行檢測。
　　 9、體外培養(yǎng)合子和動合子,并計數(shù)
　　 尾靜脈采集Py17XL(1×106PRBC)感染DV/Pys48免疫后小鼠的第3天血液10μl于0.5ml離心管中,加入動合子培養(yǎng)液90μl。24℃培養(yǎng)2

21、4h,收集培養(yǎng)懸液,取1μl懸液滴于熒光載片,冷丙酮固定10min。用含5%脫脂奶粉的PBS37℃封閉30min,加入抗Pys25McAbs(1:200稀釋),37℃孵育2h。加入FITC標記的羊抗鼠IgG(1:100稀釋)20μl,37℃孵育60min,封片,熒光顯微鏡下計數(shù)合子和動合子的形成數(shù)量。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1、rPvs48的表達結(jié)果及檢測
　　 成功構(gòu)建rPvs48的大腸桿菌表達系統(tǒng),經(jīng)經(jīng)37

22、℃,1mMIPTG誘導(dǎo)3h后,行SDS-PAGE,可見大量目標蛋白Pvs48(～48kD)的表達,同時發(fā)現(xiàn)目標蛋白以包涵體的形式基本存在于破菌沉淀中。進一步對包涵體增溶,再將目標蛋白經(jīng)過His-tag親和柱純化,并對洗脫及透析后的樣品進行Westernblot檢測,均可清晰看到目標蛋白條帶,檢測其蛋白純度＞80%。
　　 2、免疫血清特異性抗體水平變化
　　 (1)rPvs48免疫血清:于初次免疫后2周,重組蛋白免疫組小

23、鼠血清特異性抗體水平開始出現(xiàn)有意義的升高。兩次加強免疫后抗體一直維持在較高水平,與單純佐劑組相比差異顯著(P＜0.01)。重組蛋白初次免疫后,抗體效價大約為1:20000,加強免疫后效價已超過1:320000,而再次加強免疫后抗體效價已超過1:640000。
　　 (2)DV/Pys48免疫血清:初次免疫后3w,疫苗免疫組小鼠血清抗體水平即開始升高。兩次加強免疫后抗體一直維持較高水平,與空質(zhì)粒組相比差異顯著(P＜0.01)。DV

24、/Pys48初次免疫后,抗體效價約為1:1600,初次加強免疫效價為1:3200,再次加強免疫后抗體效價達1:6400。
　　 3、免疫血清特異性抗體對天然配子體抗原的識別
　　 通過間接免疫熒光實驗,經(jīng)重組蛋白免疫組抗血清處理后的玻片,在熒光顯微鏡下可見帶有綠色熒光的圓球形的配子體,而單純佐劑組未見配子體。證實用重組蛋白免疫小鼠,獲得的血清中抗體能特異性結(jié)合天然配子體表面抗原。
　　 4、核酸疫苗免疫小鼠脾細胞

25、培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4水平
　　 DV/Pys48免疫組脾細胞上清中IL-4水平明顯升高,與空質(zhì)粒對照組及正常對照組IL-4水平相比,有顯著差異(P＜0.05)。脾細胞上清中IFN-γ水平在DV/Pys48免疫組與空質(zhì)粒對照組和正常對照組間,無明顯差異(P＞0.05)。提示DV/Pys48免疫小鼠后,機體IFN-γ維持在正常水平,IL-4維持在較高水平。
　　 5、核酸疫苗免疫小鼠脾細胞中DCs亞群的數(shù)量

26、　　 DV/Pys48免疫組CD11C+CD11b+DCs(mDCs)的數(shù)量雖然高于空質(zhì)粒對照組和正常對照組,但沒有顯著差異(P＞0.05)。脾細胞中CD11c+CD45R/B220+DCs(pDCs)的數(shù)量在疫苗免疫組出現(xiàn)有意義地升高,與空質(zhì)粒對照組和正常對照組之間具有明顯差異(P＜0.05)。
　　 6、核酸疫苗免疫小鼠脾細胞中DCs胞內(nèi)TLR9的表達水平
　　 疫苗免疫組小鼠表達TLR9的CD11c+DCs的數(shù)量

27、明顯高于空質(zhì)粒對照組和正常對照組,而空質(zhì)粒對照組表達TLR9的DCs的數(shù)量與正常對照組間無明顯差異。
　　 7、核酸疫苗免疫小鼠后脾細胞中分泌IgG抗體的B細胞數(shù)量
　　 核酸疫苗免疫小鼠后,脾細胞中分泌IgG抗體的B細胞數(shù)明顯高于空質(zhì)粒對照組和正常對照組(P＜0.05),且分泌IgG抗體的B細胞數(shù)在空質(zhì)粒對照組與J下常對照組間無顯著差異。
　　 8、合子,動合子培養(yǎng)及計數(shù)
　　 與對照組再感染Py17L

28、相比,DV/Pys48免疫組再感染Py17XL后,其感染的血液經(jīng)動合子培養(yǎng)基培養(yǎng),可見合子和動合子的數(shù)量明顯減少,具有顯著差異。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功構(gòu)建間日瘧原蟲rPvs48原核表達系統(tǒng),在體外可以大量表達目標蛋白。
　　 2、純化后的rPvs48經(jīng)動物免疫證實具有良好的免疫原性。
　　 3、rPvs48免疫血清中的抗體能特異性結(jié)合天然配子體表面抗原。
　　 4、DV/Pys48確實具有