瘧疾傳播阻斷疫苗新型候選抗原的篩選及其傳播阻斷效應(yīng)研究.pdf

1、目的：
　　通過生物信息學(xué)分析，原核表達、真核表達，免疫血清的傳播阻斷效果分析，基因敲除等方面研究，篩選具有傳播阻斷活性的TBV新型候選抗原。
　　方法：
　　1、四種候選抗原的來源及生物信息學(xué)分析
　　PlasmoDB數(shù)據(jù)庫獲取瘧原蟲“假設(shè)蛋白”的基因信息，從中選擇四種“有性階段假設(shè)蛋白”，基因序列號分別為PBANKA_135340、PBANKA_030590、PBANKA_041720、PBANKA_0313

2、70并對這些基因進行生物學(xué)信息，根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果截取特定的區(qū)域進行基因擴增和重組蛋白表達。
　　2、四種候選抗原的原核表達載體、真核表達載體構(gòu)建
　　小鼠感染瘧原蟲至原蟲血癥到50％時，心臟采血，提取瘧原蟲基因組DNA。以基因組DNA為模板PCR方法擴增PBANKA_135340;PBANKA_030590;PBANKA_041720; PBANKA_031370截短基因，并克隆入相應(yīng)原核表達載體和真核表達載體，酶切和

3、測序驗證。
　　3、四種候選抗原的蛋白表達及純化
　　將原核表達載體轉(zhuǎn)化到E.coli表達菌株RGB中進行擴增，加入IPTG誘導(dǎo)表達重組蛋白，SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白的表達情況，親和層析方法純化重組蛋白。采用Bradford法檢測重組蛋白濃度。
　　4、四種候選抗原的重組蛋白免疫血清獲得
　　6～8w雌性BALB/c小鼠，分別免疫四種重組蛋白，首次免疫采用完全弗氏佐劑充分乳化后，進行皮下注射免疫。分別于初

4、次免疫后3w和6w，以等量重組蛋白加不完全弗氏佐劑加強免疫。免疫前3天及免疫后2w、5w、8w進行小鼠尾尖采血，收集免疫血清待測。同時以PBS免疫做為對照組。
　　5、重組蛋白的免疫原性和反應(yīng)原性檢測。
　　應(yīng)用Western-blot方法，將重組蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，以重組蛋白免疫血清為一抗，以HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，ECL發(fā)光檢測重組蛋白的免疫原性和反應(yīng)原性。
　　6、四種候選抗原在瘧原蟲各發(fā)

5、育階段表達定位。
　　體外培養(yǎng)及分離純化瘧原蟲裂殖體、配子體、動合子，并提取這三個階段的蟲抗原進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育重組蛋白免疫血清作為一抗，Western_blot方法檢測四種候選抗原在瘧原蟲各發(fā)育階段的表達定位。
　　同時將純化后的原蟲裂殖體、配子體、動合子涂熒光片，加入1∶50倍稀釋重組蛋白免疫血清，通過IFA實驗觀察四種候選抗原在瘧原蟲各發(fā)育階段定位。
　　7、四種候選抗原的傳播阻斷效應(yīng)評價

6、>　　四種候選抗原的真核表達載體質(zhì)粒免疫小鼠，經(jīng)過3次免疫以后，用伯氏瘧原蟲進行攻擊，每只鼠感染P.berghei(1×107 RBC)，在感染后的第三天尾靜脈取血，加入動合子培養(yǎng)基體外培養(yǎng)動合子，熒光顯微鏡下計數(shù)動合子形成數(shù)量。P.berghei(1×107 RBC)感染正常BALB/c小鼠，3天后收集感染小鼠血液，離心去除血清，加入四種候選抗原的重組蛋白免疫血清或PBS免疫對照血清(1∶10)重新制備血液，體外培養(yǎng)動合子，計數(shù)動合子

7、形成數(shù)量。用動合子形成數(shù)量評價傳播阻斷效應(yīng)，并選擇傳播阻斷效果最明顯的一種候選抗原進行以下實驗。
　　8、PBANKA-041720基因敲除型瘧原蟲獲得
　　根據(jù)PlasmoDB上提供的PBANKA-041720序列信息，設(shè)計引物，構(gòu)建基因敲除載體，經(jīng)鑒定正確后，將質(zhì)粒線性化并電轉(zhuǎn)染瘧原蟲裂殖體，裂殖體經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，給予乙胺嘧啶進行藥物篩選。發(fā)現(xiàn)小鼠有瘧原蟲感染后用PCR方法進行鑒定，用生理鹽水稀釋小鼠血液進行克隆

8、，從而獲取基因型一致瘧原蟲。
　　9、ΔPBANKA-041720型瘧原蟲表型與功能分析
　　P.berghei與ΔPBANKA-041720型瘧原蟲感染鼠尾靜脈取血，體外培養(yǎng)動合子，IFA實驗觀察動合子形態(tài)學(xué)變化。
　　P.berghei與ΔPBANKA-041720型瘧原蟲均以(1×107 RBC)感染BALB/c小鼠，統(tǒng)計原蟲血癥和小鼠生存率。
　　P.berghei與ΔPBANKA-041720瘧原蟲感染

9、鼠血體外培養(yǎng)動合子并計數(shù)動合子形成數(shù)量。
　　結(jié)果：
　　1、四種候選抗原的來源及生物信息學(xué)分析
　　本研究中選擇的四種候選抗原與間日瘧、惡性瘧均具有同源基因，選擇四種候選抗原的膜外區(qū)和抗原決定簇豐富的區(qū)域進行基因擴增和蛋白表達。
　　2、四種候選抗原原核/真核表達載體構(gòu)建
　　使用PlasmoDB網(wǎng)站獲取的基因相關(guān)信息，通過軟件primer-premier5.0設(shè)計四種候選抗原基因的真核/原核表達載體引物

10、，以基因組DNA為模板PCR方法擴增目的基因，使用分子克隆的方法構(gòu)建真核、原核表達載體，酶切鑒定正確，測序正確。
　　3、四種候選抗原的蛋白表達與純化
　　原核載體導(dǎo)入大腸桿菌表達系統(tǒng)，經(jīng)20℃，1mM IPTG誘導(dǎo)12h后，SDS-PAGE電泳檢測，可見大量目的蛋白表達，大小與預(yù)期結(jié)果一致。再將目的蛋白經(jīng)過His-tag親和柱純化，并對洗脫及透析后的樣品進行Western blot檢測，均可清晰看到目的蛋白條帶，檢測蛋白純

11、度均在＞90％以上，濃度在0.5-1μg/μL之間可以作為抗原免疫動物。
　　4、四種候選抗原的重組蛋白免疫血清獲得
　　通過動物免疫獲得了四種候選抗原的重組蛋白免疫血清，并對免疫血清的抗體效價進行檢測，結(jié)果于初次免疫后，重組蛋白免疫組小鼠血清特異性抗體水平開始出現(xiàn)有意義的升高。兩次加強免疫后抗體一直維持在較高水平，與PBS免疫對照組相比差異顯著(P＜0.01)。說明四種重組蛋白具有很好的免疫原性。
　　5、四種候選抗

12、原的免疫原性及反應(yīng)原性檢測
　　Western blot檢測重組蛋白免疫血清可以和純化的重組蛋白發(fā)生反應(yīng)，說明重組蛋白具有免疫原性，同時重組蛋白免疫血清也可以識別瘧原蟲抗原，證實重組蛋白具有反應(yīng)原性。
　　6、四種候選抗原在瘧原蟲各發(fā)育階段表達定位。
　　通過western-blot方法和IFA方法對四種候選抗原在瘧原蟲各發(fā)育階段的表達定位可知，PBANKA_030590表達在裂殖體和動合子階段，PBANKA_1353

13、40表達在動合子階段，PBANKA_041720表達在配子體和動合子階段，PBANKA_031370表達在裂殖體、合子動合子階段。
　　7、四種候選抗原的傳播阻斷效應(yīng)評價
　　真核質(zhì)粒免疫血清和重組蛋白免疫血清對四種候選抗原的傳播阻斷效應(yīng)證實，四種候選抗原均具有一定的傳播阻斷效果，其中PBANKA_041720傳播阻斷效果最明顯，阻斷動合子形成的效率為49.12％。
　　8、ΔPBANKA_041720型瘧原蟲獲得

14、r>　　構(gòu)建PBANKA_041720基因敲除載體，電轉(zhuǎn)染瘧原蟲，通過PCR鑒定、有限稀釋法克隆和Southern-blot鑒定，獲得ΔPBANKA_041720型瘧原蟲。
　　9、ΔPBANKA_041720型瘧原蟲表型及功能分析
　　基因敲除型瘧原蟲與野生型瘧原蟲體外培養(yǎng)動合子，未能見到明顯差異。兩種瘧原蟲感染小鼠后，基因敲除型瘧原蟲感染的小鼠與野生型瘧原蟲感染的小鼠比較生存率提高，原蟲血癥差異不顯著。兩種瘧原蟲體外培養(yǎng)

15、動合子，計數(shù)動合子形成數(shù)量差異顯著。
　　結(jié)論：
　　1、四種候選抗原具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。
　　2、四種候選抗原中PBANKA_031370，PBANKA_135340為配子體、合子、動合子等瘧原蟲有性階段表面抗原。PBANKA_030590，PBANKA_041720在裂殖體、配子體動合子等瘧原蟲無性和有性階段均有表達。
　　3、四種候選抗原中均有傳播阻斷效應(yīng)，其中PBANKA_041720的傳播阻斷