約氏瘧原蟲Pys25和Pys48抗原在大腸桿菌和家蠶細(xì)胞中的表達(dá)與初步研究.pdf

1、約氏瘧是由約氏瘧原蟲引起的瘧疾，主要發(fā)生在非洲，其宿主為鼠。由于不同瘧原蟲之間的表面抗原有很多同源性非常高，結(jié)構(gòu)高度保守，故約氏瘧原蟲在實(shí)驗(yàn)室常用來免疫小鼠，在免疫反應(yīng)中作為一種模型為其他瘧疾的研究提供參考。
　　Pys25和Pys48分別是約氏瘧原蟲有性生殖階段動(dòng)合子時(shí)期和配子體時(shí)期的表面抗原，其結(jié)構(gòu)均高度保守，且已有的研究顯示其抗體均有顯著的傳播阻斷效應(yīng)。我們選擇其進(jìn)行研究，通過原核表達(dá)和家蠶表面展示表達(dá)目的蛋白，單獨(dú)免疫制備

2、抗體和聯(lián)合免疫(Pys25+Pys48)制備抗體，比較其傳播阻斷效果，目的在于驗(yàn)證家蠶表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)越性，在于驗(yàn)證兩種抗原同時(shí)免疫是否具有協(xié)同性，在于為后期多時(shí)期多價(jià)疫苗的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)，在于建立一種鼠瘧模型，為其他瘧疾的研究提供參考。
　　首先，我們構(gòu)建原核重組表達(dá)菌BL21-pGEX-4T-1-Pys25和Rosseta-pET-32a-Pys48，分別經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，高壓破碎菌體，離心分上清沉淀，Pys25上清直接用GST

3、柱親和純化;Pys48幾乎都表達(dá)在沉淀，我們用洗包涵體的方法獲得較純的目的蛋白。重組蛋白經(jīng)濃縮、BCA定量后，免疫Balb/c小鼠制備多克隆抗體。同時(shí)，我們利用家蠶表面展示系統(tǒng)原理，改造pFastBacDual載體，在其Ph啟動(dòng)子前端加入哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子CMV，構(gòu)建重組病毒vBmPys25、vBmPys48，在家蠶細(xì)胞中成功表達(dá)重組蛋白，經(jīng)免疫熒光檢測，激光共聚焦顯微鏡觀察目的蛋白成功展示在細(xì)胞膜表面，經(jīng)超速50000rpm離心獲取桿狀病