負(fù)性共刺激分子B7-H1在A2B5陽(yáng)性人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞中的負(fù)性調(diào)控作用探討.pdf

1、[目的]
　　體外培養(yǎng)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，從中分離鑒定腦腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞(brain tumor stem-like cells，BTSCs)；觀察BTSCs的生物學(xué)特性，包括形態(tài)學(xué)、單克隆形成率、增殖曲線、成瘤能力以及分化能力；通過(guò)多種方法比較負(fù)性共刺激分子B7-H1在BTSCs和非BTSCs中的表達(dá)；體外實(shí)驗(yàn)觀察BTSCs的免疫學(xué)特性，以及是否較非BTSCs更利于通過(guò)B7-H1途徑逃逸機(jī)體的免疫監(jiān)控。
　　[方法]
　　

2、用無(wú)血清培養(yǎng)液(含EGF、bFGF和B27)培養(yǎng)6例原代膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和1例人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87，觀察其在不同培養(yǎng)條件下(無(wú)血清和含血清培養(yǎng))的生長(zhǎng)特性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)無(wú)血清培養(yǎng)條件下的原代膠質(zhì)母細(xì)胞瘤A285和CD133的表達(dá)率。用流式細(xì)胞儀分選無(wú)血清培養(yǎng)的U87和原代膠母細(xì)胞，將其分為A285陽(yáng)性細(xì)胞群和A285陰性細(xì)胞群，比較兩群細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)形態(tài)；單克隆形成實(shí)驗(yàn)和XTT法比較這兩群細(xì)胞以及未分選膠母細(xì)胞的增殖能力：

3、免疫熒光法鑒定干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)以及血清培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化后的分化標(biāo)志物的表達(dá)；裸鼠腹股溝皮下注射觀察兩群細(xì)胞的成瘤能力，以鑒定BTSCs。
　　分別用免疫熒光法、Western Blot法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)負(fù)性共刺激分子B7-H1在6例原代膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分選后得到的A285陽(yáng)性細(xì)胞群和A285陰性細(xì)胞群中的表達(dá)情況，并比較兩者的差別；用流式雙標(biāo)法檢測(cè)U87細(xì)胞系以及本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期培養(yǎng)的SHG62、SHG66細(xì)胞系A(chǔ)285和B7-H1的表達(dá)

4、情況，并比較B7-H1在長(zhǎng)期離體培養(yǎng)條件下的A285陽(yáng)性細(xì)胞群和A285陰性細(xì)胞群中表達(dá)情況的差別。
　　將原代膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分選后得到的A285陽(yáng)性細(xì)胞群和A285陰性細(xì)胞群分別制備抗原；提取患者自體外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，其中的貼壁細(xì)胞經(jīng)GM-SF和IL-4刺激誘導(dǎo)上調(diào)樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)比例，分別加入上述兩群抗原后獲得

5、成熟DCs，之后與來(lái)自PBMCs的非貼壁細(xì)胞共培養(yǎng)獲得活化的效應(yīng)細(xì)胞(即cytotoxic T lymphocytes，CTLs)，然后分多組用CSFE/PI法進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)、XTT法進(jìn)行特異性T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，比較A285陽(yáng)性細(xì)胞群和A285陰性細(xì)胞群的免疫學(xué)特性、以及對(duì)B7-H1進(jìn)行干預(yù)前后各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差別。將未分選的人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87在三種條件下培養(yǎng)：1)有血清貼壁培養(yǎng)；2)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)；3)放化療干預(yù)條件下無(wú)血清懸浮培養(yǎng)

6、。分別檢測(cè)對(duì)B7-H1進(jìn)行干預(yù)前后T細(xì)胞對(duì)各組細(xì)胞殺傷率的差別。
　　[結(jié)果]
　　原代膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在無(wú)血清培養(yǎng)條件下部分呈懸浮生長(zhǎng)形成腫瘤球、部分呈貼壁生長(zhǎng)；U87細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)條件下呈懸浮生長(zhǎng)。原代腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)流式分選后得到的A2B5陽(yáng)性細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)，并形成腫瘤球；A2B5陰性細(xì)胞亦呈懸浮生長(zhǎng)，但極少能形成腫瘤球。單克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5.73％±0.64％的A2B5陽(yáng)性細(xì)胞能形成單細(xì)胞克隆球、未分選的細(xì)胞有3.01％

7、±0.50％能形成單細(xì)胞克隆球、而A2B5陰性細(xì)胞的單克隆形成率為0％；通過(guò)XTT法繪制生長(zhǎng)曲線時(shí)發(fā)現(xiàn)A2B5陽(yáng)性細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)液下的生長(zhǎng)速度較未分選細(xì)胞和A2B5陰性細(xì)胞快。體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)106個(gè)A2B5陽(yáng)性細(xì)胞能在裸鼠皮下成瘤，H&E染色提示繼發(fā)腫瘤符合腦膠質(zhì)瘤的典型組織學(xué)特性；A2B5陰性細(xì)胞多至10’級(jí)別亦不能在裸鼠皮下成瘤。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)無(wú)血清培養(yǎng)條件下的A285陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin和CD133；在含血清

8、分化培養(yǎng)條件下表達(dá)分化標(biāo)記物GFAP、β-tubulin和CNPase。流式雙標(biāo)染色結(jié)果表明：A2B5陽(yáng)性細(xì)胞中含有CD133陽(yáng)性細(xì)胞及CD133陰性細(xì)胞；而A2B5陰性細(xì)胞均為CD133陰性細(xì)胞，不存在A2B5-CD133+細(xì)胞，A2B5陽(yáng)性細(xì)胞囊括了所有CD133陽(yáng)性膠質(zhì)瘤細(xì)胞。
　　通過(guò)對(duì)原代膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分選后得到的兩群細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，我們發(fā)現(xiàn)：A2B5陽(yáng)性細(xì)胞和A2B5陰性細(xì)胞均能表達(dá)負(fù)性共刺激分子B7-H1，并且A

9、2B5陽(yáng)性細(xì)胞B7-H1的表達(dá)水平較A2B5陰性細(xì)胞高；對(duì)上述兩群細(xì)胞進(jìn)行Western Blot法檢測(cè)B7-H1蛋白的結(jié)果表明：B7-H1蛋白在A2B5陽(yáng)性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞中的表達(dá)水平較A2B5陰性腫瘤細(xì)胞高；對(duì)上述兩群細(xì)胞進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)B7-H1的表達(dá)量，結(jié)果提示：A2B5陽(yáng)性細(xì)胞和A2B5陰性細(xì)胞均能表達(dá)負(fù)性共刺激分子B7-H1，但B7-H1在前者的表達(dá)水平高于后者(39.50％±8.76％Vs16.41％±5.41％

10、)。對(duì)長(zhǎng)期體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系進(jìn)行流式雙標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果提示：B7-H1在A2B5陽(yáng)性細(xì)胞和A285陰性細(xì)胞中的表達(dá)率分別為31.22％±24.04％和42.52％±25.20％，兩者之間的差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
　　通過(guò)腫瘤抗原致敏DCs體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)(殺傷實(shí)驗(yàn))我們發(fā)現(xiàn)：BTSCs抗原致敏的效應(yīng)細(xì)胞較非BTSCs抗原致敏的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞(不管是BTSCs還是非BTSCs)的殺傷活性高(19.09％±2.89％Vs12.6

11、9％±3.47％：30.05％±4.98％Vs23.09％±1.04％，P<0.05)；用同種抗原致敏的效應(yīng)細(xì)胞(不管是用BTSCs抗原還是以非BTSCs抗原致敏)對(duì)于BTSCs的殺傷率低于對(duì)非BTSCs的殺傷率(19.09％±2.89％Vs30.05％±4.98％；12.69％±3..47％Vs23.09％±1.04％，P<0.01)；利用封閉抗體將B7-H1封閉后效應(yīng)細(xì)胞對(duì)于BTSCs的殺傷率明顯增加(29.77％±3.05％Vs1

12、9.09％±2.89％，P<0.01)，平均增加率為55.95％，而效應(yīng)細(xì)胞對(duì)于非BTSCs的殺傷率增加不顯著(33.71％±6.08％Vs30.05％±4.98％，P>0.05)，效應(yīng)細(xì)胞對(duì)于BTSCs和非BTSCs的殺傷率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(29.77％±3.05％Vs33.71％±6.08％，P>0.05)。
　　通過(guò)特異性T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)：A2B5+BTSCs能顯著抑制自體T細(xì)胞的增殖，將B7-H1配體封閉后T細(xì)胞的增殖活

13、性部分恢復(fù)；A285細(xì)胞對(duì)自體T細(xì)胞的增殖活性抑制不明顯。
　　通過(guò)對(duì)在三種不同培養(yǎng)條件下的U87細(xì)胞進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)，按第1)、第2)、第3)組腫瘤細(xì)胞，未封閉B7-H1在前、封閉了B7-H1在后的順序，T細(xì)胞殺傷率依次為：24.56％、25.70％、17.00％、12.80％、24.30％和23.18％；通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，我們發(fā)現(xiàn)：將B7-H1封閉前后三組腫瘤細(xì)胞的平均被殺傷率分別為21.95％±4.29％和20.56％±6.84％，

14、兩者之間的差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
　　[結(jié)論]
　　A285陽(yáng)性膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有BTSCs特性，且A285陽(yáng)性膠質(zhì)瘤細(xì)胞囊括了所有CD133+BTSCs，表明A2B5能作為分選BTSCs的一種高效標(biāo)記；A2B5+BTSCs能誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫抑制，而A2B5非BTSCs不具有免疫抑制性；A2B5+BTSCs不僅在數(shù)量上較A2B5非BTSCs高表達(dá)負(fù)性共刺激分子B7-H1，且在功能上更利于通過(guò)B7-H1途徑實(shí)施免疫逃逸；將PD-1/