負(fù)性共刺激分子B7-H4表達(dá)模式及功能研究.pdf

1、B7-H4是2003年由多位科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的B7家族的一個(gè)成員，屬協(xié)同刺激分子的一類，在限制、終止和削弱T細(xì)胞的免疫應(yīng)答中提供了重要的負(fù)性共刺激信號(hào)。在淋巴組織和非淋巴組織中能檢測(cè)到B7-H4mRNA的廣泛表達(dá)，但其蛋白卻在這些正常組織中檢測(cè)不到。相反，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在人類許多惡性腫瘤如卵巢癌、腎癌及胃癌中該分子卻呈高表達(dá)，研究表明 B7-H4在幫助腫瘤細(xì)胞逃逸免疫應(yīng)答過(guò)程中起到了非常重要的作用。由于研究者一開(kāi)始就發(fā)現(xiàn)B7-H4分子含有信號(hào)肽，

2、并可與活化T細(xì)胞表面受體結(jié)合抑制T細(xì)胞增殖，因此B7-H4分子一開(kāi)始就被定位為膜蛋白。但是之后有研究發(fā)現(xiàn)在許多腫瘤細(xì)胞內(nèi)B7-H4不表達(dá)于細(xì)胞膜而表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)。而我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)人B7-H4含有核定位序列，推測(cè)該分子可能是一雙定位蛋白。為研究核定位序列對(duì)B7-H4功能的影響，本文構(gòu)建了B7-H4野生型與核定位序列突變體轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行研究，本研究為負(fù)型共刺激分子功能的研究提供了新思路。
　　本論文主要包括以下三部分內(nèi)容：
　　

3、一、B7-H4在腫瘤細(xì)胞中的亞定位
　　在SK-BR-3，MDA-MB-453，MCF-7，U937和 THP-1細(xì)胞株中加入核輸出抑制劑LMB，使B7-H4分子在細(xì)胞核中堆積，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察B7-H4分子在細(xì)胞中的亞定位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 LMB的作用下B7-H4可聚集在細(xì)胞核，說(shuō)明人B7-H4分子可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，這一結(jié)果說(shuō)明B7-H4分子不僅僅是一單純的膜蛋白，還可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核。
　　二、人B7-H4野生型基因

4、的克隆及突變體基因的構(gòu)建
　　我們用軟件分析人B7-H4的基因序列，發(fā)現(xiàn)其中有一段核定位信號(hào)序列（NLS）-KRRSH，而鼠源性的B7-H4則無(wú)。且在鼠源性B7-H4中與KRRSH所對(duì)應(yīng)的序列為KRRSQ。我們通過(guò)RT-PCR法克隆出野生型B7-H4基因，然后應(yīng)用定點(diǎn)突變法獲得無(wú)NLS的B7-H4突變體基因，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)后再將野生型及突變體基因分別與真核質(zhì)粒pIRES2-EGFP連接，并經(jīng)雙酶切與測(cè)序確認(rèn)。
　　三、人B7-H

5、4野生型基因及突變體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的構(gòu)建及細(xì)胞毒分析和促細(xì)胞增殖的研究
　　將上述實(shí)驗(yàn)獲得的野生型B7-H4基因（B7-H4-WT）、突變體B7-H4基因（B7-H4-MT）和真核質(zhì)粒pIRES2-EGFP基因用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)法分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入腎細(xì)胞癌786-O中，然后進(jìn)行細(xì)胞毒分析。發(fā)現(xiàn)在抗腫瘤藥物（五氟尿嘧啶、長(zhǎng)春新堿、阿霉素）的作用下三組轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株中B7-H4-WT細(xì)胞組的抵抗細(xì)胞毒性的能力最強(qiáng)，其次為突變組，Mock組的最弱。然后

6、研究這些細(xì)胞株的增殖率。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們分別測(cè)定0h、24h、48h、72h和96h的細(xì)胞數(shù)目來(lái)研究其增殖率，發(fā)現(xiàn)B7-H4-WT轉(zhuǎn)基因細(xì)胞組的增殖率最高，其次為突變體組與MOCK組，兩者相差不多。以上結(jié)果說(shuō)明B7-H4促進(jìn)細(xì)胞增殖及賦予細(xì)胞抗凋亡作用與其核轉(zhuǎn)移功能密切相關(guān)。
　　本研究首先分析了B7-H4分子在腫瘤細(xì)胞中的亞定位，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷其能在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)間轉(zhuǎn)移，并存在一核定位序列。我們分析其序列確認(rèn)了NLS的存在。然后