鼠抗人B7-H4單克隆抗體的研制及B7-H4分子在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)特性的分析.pdf

1、B7-H4分子是新近發(fā)現(xiàn)的B7家族又一負(fù)性協(xié)同刺激分子。盡管其mRNA在淋巴和非淋巴組織中呈廣泛性表達(dá)，但由于受到轉(zhuǎn)錄后水平的嚴(yán)格調(diào)控，B7-H4蛋白僅在正常組織中呈現(xiàn)微弱的表達(dá)。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、腎癌和腺樣囊性癌等的腫瘤細(xì)胞以及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中異常高表達(dá)B7-H4分子。在B7-H4信號(hào)的作用下，腫瘤周圍的CD3<'+>T細(xì)胞數(shù)量顯著減少，活化CTL的增殖受到明顯抑制，機(jī)體抵抗腫瘤的免疫應(yīng)答大為削弱

2、。與此同時(shí)，B7-H4分子還能抑制腫瘤自身的凋亡，促進(jìn)上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，為腫瘤免疫逃逸提供了必要的條件。臨床研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞B7-H4的表達(dá)與臨床和病理學(xué)特征息息相關(guān)。高表達(dá)B7-H4的患者往往腫瘤惡性程度高，預(yù)后結(jié)果差。此外，在腫瘤患者血清中高水平可溶性B7-H4分子的存在，還為腫瘤患者的臨床診斷，尤其是卵巢癌的早期發(fā)現(xiàn)，提供了新的檢測(cè)指標(biāo)和依據(jù)。為此，繼負(fù)性協(xié)同刺激分子B7-H1，B7-H4成為研究腫瘤免疫逃逸和臨床診斷治療的新熱

3、點(diǎn)。 本研究旨在以高表達(dá)B7-H4的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞為抗原，應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)，研制鼠抗人B7-H4單克隆抗體，為進(jìn)一步探求B7-H4分子在腫瘤免疫逃逸中的生物學(xué)特性和意義提供有效的研究手段，進(jìn)而為臨床診斷、預(yù)后和治療開拓新的道路。 一．鼠抗人B7-H4分子功能性單克隆抗體的研制及生物學(xué)特性的鑒定. 【目的】研制鼠抗人B7-H4單克隆抗體，為探討人B7-H4分子在免疫細(xì)胞上的表達(dá)特性及其介導(dǎo)的負(fù)性信號(hào)對(duì)人T淋巴細(xì)胞抑制

4、作用的效應(yīng)提供必備的研究手段。 【方法】以高表達(dá)人B7-H4分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株293T/B7-H4為免疫原，常規(guī)免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合，并以該基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞293T/B7-H4作為陽(yáng)性篩選細(xì)胞，以轉(zhuǎn)空質(zhì)粒的對(duì)照細(xì)胞293T/Mock作為陰性對(duì)照細(xì)胞。經(jīng)間接免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)分析、反復(fù)篩選和多次克隆化培養(yǎng)，獲得能特異分泌鼠抗人B7-H4分子單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；采用細(xì)胞核染色體計(jì)數(shù)、I

5、g亞型快速定性試紙法、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抑制以及Western blot等實(shí)驗(yàn)對(duì)獲得的雜交瘤細(xì)胞株及單克隆抗體進(jìn)行生物學(xué)特性的鑒定；用間接免疫熒光法初步分析單抗對(duì)正常人外周血淋巴細(xì)胞表面BT-H4蛋白的識(shí)別作用以及單核一樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)過(guò)程中B7-H4分子表達(dá)的變化。向293T/B7-H4與T細(xì)胞的混合反應(yīng)體系中加入單抗3C8，用<'3>H-TdR摻入法檢測(cè)單抗對(duì)B7-H4信號(hào)抑制活化T細(xì)胞增殖的阻斷效應(yīng)。 【結(jié)果】成功獲得了1株持續(xù)、穩(wěn)定

6、分泌鼠抗人B7-H4單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株3C8，細(xì)胞核型分析顯示，雜交瘤細(xì)胞株的染色體數(shù)目在100條以上，超過(guò)小鼠B細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞的染色體數(shù)，為兩者融合體細(xì)胞：快速定性試紙分析顯示，這株單抗輕鏈為к鏈，重鏈為IgGl亞類；Western blot分析結(jié)果顯示單抗3C8能與B7-H4分子特異性結(jié)合，形成陽(yáng)性條帶；單抗識(shí)別的抗原表位分析結(jié)果表明，單抗3C8與商品化抗體H74識(shí)別的抗原表位較為接近，而與科室已有的一株鼠抗人B7-H4

7、單抗1G7的抗原識(shí)別表位完全不同。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，單抗3C8能檢測(cè)到健康人外周血CD14<'+>單核細(xì)胞上B7-H4的表達(dá)，而在CD4<'+>、CD8<'+>、CD19<'+>和CD56<'+>淋巴細(xì)胞上則均未檢測(cè)到BT-H4分子。此外，在單核一樹突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)過(guò)程中，IL-4能下調(diào)B7-H4的表達(dá)，而LPS刺激imDC后則能上調(diào)表達(dá)B7-H4，GM-CSF對(duì)B7-H4表達(dá)的影響不明顯。<'3>H-TdR結(jié)果顯示，單抗3C8能有

8、效地阻斷B7-H4信號(hào)對(duì)活化T細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)。 【結(jié)論】成功獲得了1株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人B7-H4阻斷型單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其不同的抗原表位為進(jìn)一步研制可溶性B7-H4分子ELISA試劑盒奠定了良好的基礎(chǔ)。同時(shí)，健康人外周血CD14<'+>單核細(xì)胞上B7-H4表達(dá)的變化以及單抗3C8對(duì)B7-H4信號(hào)地阻斷作用，為進(jìn)一步研究機(jī)體免疫自穩(wěn)和免疫調(diào)節(jié)開拓了道路。 二．B7-H4分子在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)特性的初步研究.

9、 【目的】探尋腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中B7-H4分子的表達(dá)特性，為進(jìn)一步研究B7-H4與腫瘤免疫逃逸及其相互關(guān)系開拓新的途徑。 【方法】采用間接免疫熒光標(biāo)記法和流式細(xì)胞術(shù)分析不同來(lái)源人腫瘤細(xì)胞株以及腫瘤患者胸、腹水中CD14<'+>單核細(xì)胞膜表面B7-H4分子的表達(dá)；采用細(xì)胞免疫組化分析B7-H4分子在腫瘤(肺癌)細(xì)胞株中的分布；Western blot鑒定腫瘤和腫瘤微環(huán)境中B7-H4蛋白的表達(dá)形式和糖基化修飾水平；同時(shí)運(yùn)用

10、RT-PCR技術(shù)檢測(cè)B7-H4分子在mRNA水平上的不同剪接形式，探求不同表達(dá)形式的B7-H4分子與腫瘤逃逸的相關(guān)關(guān)系。 【結(jié)果】在多株腫瘤細(xì)胞，尤其是上皮性腫瘤細(xì)胞株(如：肺癌、胃癌)表面存在B7-H4分子的表達(dá)。腫瘤患者胸、腹水中的單核細(xì)胞不同于健康人外周血單一的B7-H4<'+>單核細(xì)胞，存在B7-H4<'+>和B7-H4<'->兩個(gè)群體。細(xì)胞免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示，腫瘤細(xì)胞株胞漿中也存在大量的B7-H4分子。Western b

11、lot結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞株、腫瘤浸潤(rùn)性單核細(xì)胞以及健康人外周血單核細(xì)胞中B7-H4分子量大小均在34KD左右，分子量較小，而RT-PCR結(jié)果則顯示，在這些腫瘤和腫瘤相關(guān)的細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到B7-H4分子剪接體的存在。 【結(jié)論】多株腫瘤細(xì)胞以及腫瘤患者胸、腹水中CD14<'+>單核細(xì)胞雖然都以正常大小的B7-H4cDNA轉(zhuǎn)錄本為主，但其表達(dá)的B7-H4蛋白分子量較小，糖基化水平不高。低糖基化水平B7-H4分子在腫瘤和腫瘤微環(huán)境中所發(fā)

12、揮的調(diào)控作用及機(jī)制值得關(guān)注和進(jìn)一步深入探討。此外，腫瘤患者胸、腹水中CD14<'+>B7-H4<'+>和CD14<'+>B7-H4<'->是否分別代表著具有不同免疫調(diào)節(jié)功能的單核巨噬細(xì)胞亞群仍有待進(jìn)一步探明。 三．抗人B7-H4單克隆抗體3C8可變區(qū)基因的克隆及嵌合輕、重鏈基因的拼接. 【目的】在已獲得的功能型單抗3C8的基礎(chǔ)上，克隆和拼接嵌合輕、重鏈基因，為抗體人源化構(gòu)建和改造鋪平道路。 【方法】根據(jù)抗體保守的

13、框架區(qū)和前導(dǎo)序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，采用RT-PCR技術(shù)克隆出單抗3C8的輕重鏈可變區(qū)：應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)所擴(kuò)增的序列進(jìn)行CDR區(qū)的分析和二級(jí)結(jié)構(gòu)定位、天然信號(hào)肽預(yù)測(cè)、抗體可變區(qū)二級(jí)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析以及三維模擬。采用TP-PCR法將分析正確的鼠源性抗體可變區(qū)基因分別與人IgGl和к鏈恒定區(qū)進(jìn)行拼接，形成嵌合輕、重鏈基因。 【結(jié)果】成功克隆到了含有信號(hào)肽序列的鼠抗人B7-H4單克隆抗體輕、重鏈可變區(qū)基因；經(jīng)生物信息學(xué)分析，抗體輕鏈可變區(qū)由

14、V1-117*01和J1*01兩個(gè)亞群基因重排后形成，而重鏈可變區(qū)則由V1-14*01和J4*01以及D2-2*01三個(gè)亞群基因重排后形成。其輕、重鏈信號(hào)肽切割位點(diǎn)分別位于SSS-DS和VHS-EV，在第19-20個(gè)氨基酸之間。二級(jí)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和三維模擬顯示，所獲序列除信號(hào)肽區(qū)為α-螺旋外，其他部分主要由β-折疊構(gòu)成，抗體CDR區(qū)位于反向平行的β-折疊之間，暴露在整個(gè)蛋白的表面，可與抗原相互結(jié)合。經(jīng)PCR拼接獲得的嵌合輕、重鏈基因大小分別約

15、為750bp和1500bp，與理論值相一致。 【結(jié)論】抗體可變區(qū)基因的成功克隆及拼接，可變區(qū)CDR區(qū)域、二級(jí)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析以及三維結(jié)構(gòu)的模擬，為進(jìn)一步展開抗體3C8的人源化以及基于DNA點(diǎn)突變技術(shù)的抗體親和力改變實(shí)驗(yàn)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 綜上所述，本項(xiàng)研究成功獲得了1株能穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人B7-H4分子的新型功能型單抗，它能有效阻斷B7-H4信號(hào)；其抗體可變區(qū)基因的克隆及嵌合輕、重鏈的拼接為繼續(xù)開展抗體人源化和靶向B7-H