B7-H4分子的抗體制備及其在腫瘤研究中的應(yīng)用.pdf

1、B7—H4，又稱B7S1或B7x，是共刺激分子B7家族的最新成員，為Ⅰ型跨膜糖蛋白，編碼282個(gè)氨基酸。由美國(guó)Mayo醫(yī)學(xué)中心于2003年發(fā)現(xiàn)，是B7家族相關(guān)的第3個(gè)T細(xì)胞抗原特異性反應(yīng)的負(fù)性調(diào)控分子。人B7—H4的cDNA長(zhǎng)約1.8Kb，位于人的染色體1p11.1，在基因組上跨越66Kbp。B7—H4的mRNA在淋巴和非淋巴組織中都有表達(dá)，但免疫組化顯示，B7—H4蛋白僅在部分正常組織中微弱的表達(dá)。B7—H4可以在活化的人T細(xì)胞、B細(xì)

2、胞、巨噬細(xì)胞、DC細(xì)胞上呈誘導(dǎo)性表達(dá)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，一些腫瘤細(xì)胞也呈組成性表達(dá)B7—H4，如乳腺癌、卵巢癌和肺癌等。對(duì)小鼠組織的Northern Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)組織類型的不同，小鼠的B7—H4共有四種不同的mRNA剪切形式。RT-PCR分析顯示，人類的組織至少擁有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本。研究表明，正常外周組織能在翻譯水平對(duì)B7—H4的表達(dá)進(jìn)行嚴(yán)密的調(diào)控。 在機(jī)體的免疫應(yīng)答過程中，B7—H4作為重要的共刺激分子，在CD4+、CD8+T細(xì)胞

3、的分化發(fā)育、細(xì)胞周期進(jìn)展以及細(xì)胞因子的產(chǎn)生等方面發(fā)揮廣泛的抑制效應(yīng)。B7—H4對(duì)外周組織的細(xì)胞免疫應(yīng)答起著負(fù)性調(diào)節(jié)的作用，且由于其特異性表達(dá)于某些腫瘤細(xì)胞表面，因而可能在機(jī)體的腫瘤免疫逃避機(jī)制中起著重要作用。 因此，B7—H4分子途徑為腫瘤、自身免疫性疾病和抗病毒及移植排斥反應(yīng)等疾病提供了新的治療思路。阻斷B7—H4與其受體的相互作用，有望成為干預(yù)自身免疫性疾病和腫瘤生物治療的潛在靶點(diǎn)。 目的：為了更深入研究B7—H4與

4、腫瘤免疫的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并合成了人B7—H4多肽，應(yīng)用該多肽制備了兔抗人B7—H4多克隆抗體，并應(yīng)用該抗體研究B7—H4分子在多種腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織中的表達(dá)，并探討其意義。 方法： 1．根據(jù)GenBank公布的序列(AAP37283)，利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，確定并人工合成B7—H4抗原多肽，并用Keyhole Limpet Hemocyanin(KLH)交聯(lián)以增強(qiáng)B7—H4抗原多肽的免疫原性。將交聯(lián)KLH的B7—H4抗原

5、肽免疫新西蘭兔(經(jīng)初次免疫和四次加強(qiáng)免疫)后獲取免疫兔血清，親和純化法純化兔血清中的抗B7—H4抗體。采用直接ELISA法，Western—blot免疫印跡鑒定抗B7—H4抗體的效價(jià)、反應(yīng)的特異性和敏感性； 2．免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)組織芯片上多種腫瘤組織中人B7—H4蛋白的表達(dá)情況； 3．根據(jù)GenBank公布的序列(NM_024626)，合成了hB7—H4的PCR引物，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)多種腫瘤細(xì)胞株中人B7—H4m

6、RNA的表達(dá)； 4．Western—Blot檢測(cè)多種腫瘤細(xì)胞株中人B7—H4蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1．成功制備了兔抗人B7—H4多克隆抗體； 2．免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌、直腸癌及腎癌等多種腫瘤組織的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿均有B7—H4蛋白的陽(yáng)性染色，而在各種對(duì)照的正常組織中僅表達(dá)為陰性至弱陽(yáng)性； 3．RT-PCR結(jié)果顯示8種腫瘤細(xì)胞株在目的條帶1200bp左右處均有B

7、7—H4mRNA的表達(dá)； 4．Western—Blot檢測(cè)9種細(xì)胞株中B7—H4蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示A549、MCF-7、SK—BR-3、CaoV3、SK—OV-3、SiHa、HeLa、HepG2等腫瘤細(xì)胞株均表達(dá)B7—H4蛋白，而A293細(xì)胞株未檢測(cè)到B7—H4蛋白表達(dá)。 結(jié)論： 1．成功制備了兔抗人B7—H4多克隆抗體； 2．肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌、直腸癌及腎癌等多種腫瘤組織的細(xì)胞膜