B7-H4在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的生物學(xué)意義研究.pdf

1、B7-H4，又稱B7x和B7S1，是B7家族共刺激分子成員之一，并且能夠抑制T細(xì)胞的免疫功能。B7-H4分子 mRNA在人體外周組織中廣泛表達(dá)，而其蛋白在正常機(jī)體內(nèi)則不表達(dá)或低表達(dá)，在眾多腫瘤細(xì)胞中則呈高表達(dá)。此外，研究發(fā)現(xiàn) B7-H4的表達(dá)水平與疾病的惡化呈正相關(guān)。早期研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4分子屬于I型跨膜糖蛋白，與淋巴細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，從而負(fù)性調(diào)控免疫反應(yīng)。然而在一些腫瘤細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn)了B7-H4在胞內(nèi)的表達(dá)。臨床組織樣本的分析

2、結(jié)果顯示，膜表達(dá)B7-H4與腫瘤浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，而胞內(nèi)表達(dá)B7-H4分子與腫瘤浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞無(wú)明顯相關(guān)性，由此可見(jiàn)，胞內(nèi)B7-H4分子有區(qū)別于膜表達(dá)B7-H4分子的生物學(xué)功能。近期研究表明，B7-H4分子含有核定位序列，能夠穿梭于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間；并且位于核內(nèi)的B7-H4分子能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、G1/S期的轉(zhuǎn)換。但是，對(duì)于B7-H4分子在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的生物學(xué)意義仍不十分清楚。本研究通過(guò)構(gòu)建Flag標(biāo)簽的B7-H4野生型（B7-

3、H4 WT）真核表達(dá)載體，瞬轉(zhuǎn)HEK293細(xì)胞，采用免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜的方法，尋找B7-H4分子在細(xì)胞內(nèi)的相互作用蛋白；并通過(guò)基因芯片的方法分析構(gòu)建的B7-H4野生型（B7-H4 WT）與核定位序列突變B7-H4（B7-H4 H250Q）的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，從而尋找B7-H4WT與B7-H4H250Q分子所引起的差異表達(dá)蛋白，更好地研究B7-H4在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的生物學(xué)意義。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜法尋找B

4、7-H4分子相互作用蛋白及其生物學(xué)功能的初步研究。
　　目的：尋找B7-H4分子相互作用蛋白，并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行初步研究。
　　方法：構(gòu)建Flag標(biāo)簽的 B7-H4野生型真核表達(dá)載體，通過(guò) lipofectamine2000瞬轉(zhuǎn)HEK293，24-48h提取總蛋白，免疫共沉淀法獲得與B7-H4分子相互作用的蛋白，將相互作用蛋白跑WB并銀染，差異條帶膠回收，打質(zhì)譜，分析數(shù)據(jù)，尋找相互作用蛋白，免疫共沉淀驗(yàn)證相互作用蛋白；以及

5、通過(guò)構(gòu)建 vector/786-O、B7-H4 WT/786-O、B7-H4 H250Q/786-O以及vector/293、B7-H4 WT/293、B7-H4 H250Q/293穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株進(jìn)行相應(yīng)功能實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：構(gòu)建了Flag標(biāo)簽的 B7-H4野生型質(zhì)粒，以及 vector/786-O、B7-H4 WT/786-O、B7-H4 H250Q/786-O以及vector/293、B7-H4 WT/293、B7-H4 H2

6、50Q/293穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株；免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜找到了野生型B7-H4分子的相互作用蛋白，并且發(fā)現(xiàn)B7-H4分子對(duì)相互作用蛋白的活性有調(diào)控作用。
　　結(jié)論：確定了B7-H4分子的互作蛋白DNA-PKcs，并初步證實(shí)B7-H4對(duì)該蛋白的活性有調(diào)控作用。
　　第二部分：尋找B7-H4野生型(B7-H4 WT)及核定位序列突變型(B7-H4H250Q)在786-O細(xì)胞中的差異表達(dá)蛋白及其功能研究。
　　目的：尋找B7-H4分

7、子引起的差異表達(dá)蛋白，并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行研究。
　　方法：通過(guò)基因芯片技術(shù)對(duì)上述構(gòu)建的vector/786-O、B7-H4 WT/786-O、B7-H4 H250Q/786-O穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株進(jìn)行分析，尋找差異表達(dá)基因，Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證差異表達(dá)蛋白，MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)比較體外細(xì)胞增殖率的差異。
　　結(jié)果：Western blot結(jié)果與基因芯片結(jié)果均發(fā)現(xiàn)一些與細(xì)胞侵襲及血管生成相關(guān)的差異表達(dá)蛋白，MTT增殖實(shí)驗(yàn)