B7-H4基因?qū)β殉舶┘毎飳W習性影響的研究.pdf

1、目的：研究在無免疫因素情況下，B7-H4基因?qū)β殉舶┘毎鸖KOV3生物學習性的影響；探討卵巢癌細胞B7-H4基因高表達對靶向誘導的CTL細胞殺傷作用的影響。 方法：從人卵巢漿液性囊腺癌組織中提取總RNA，通過RT-PCR技術擴增B7-H4核心序列，構建B7-H4真核表達載體PEGFP-N1/B7-H4，以空質(zhì)粒PEGFP-NI作為陰性對照，分別轉染至人上皮性卵巢癌細胞株SKOV3篩選獲得穩(wěn)定克隆，分別命名為SKOV3/B7-H4

2、、SKOV3/neo。通過RT-PCR、熒光技術分別進行mRNA及蛋白水平的鑒定。實驗分成實驗組（SKOV3/B7-H4組）、陰性對照組（SKOV3/neo組）和空白對照組（SKOV3組），通過MIT實驗、流式細胞儀細胞周期和凋亡測定、集落形成實驗、細胞黏附實驗、劃痕實驗、Transwell小室侵襲實驗檢測在無免疫因素情況下B7-H4對卵巢癌細胞的影響。利用免疫磁珠分離法（MACS）分離純化臍血CD34+細胞并在體外誘導分化為DC，用反

3、復凍融法從SKOV3中提取可溶性凍融抗原并負載DC誘導生成CTL。MTT法檢測CTL細胞對三組細胞的殺傷作用。 結果： （1）成功構建了B7-H4基因真核表達載體，建立穩(wěn)定表達B7-H4蛋白細胞株SKOV3/B7-H4及陰性對照組細胞株SKOV3/neo。三組細胞中，實驗組B7-H4mRNA表達陽性，融合蛋白定位于細胞膜上，空白對照組及陰性對照均無B7-H4mRNA及蛋白的表達。細胞形態(tài)、核漿比例、排列方式無明顯改變。

4、 （2）通過MTT實驗檢測細胞增殖能力，培養(yǎng)48h后，實驗組積分吸光度分別與陰性對照組及空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），空白對照組與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；三組細胞生長曲線顯示，實驗組明顯快于陰性及空白對照組。 （3）實驗組集落形成數(shù)為15.25±7.27個，與陰性對照組（13.50±7.55個）及空白對照組（13.75±8.73個）集落形成數(shù)兩兩比較，無統(tǒng)計學差異（P>0.05），

5、但實驗組集落形成直徑大，細胞數(shù)量較多，細胞排列較緊密。 （4）檢測三組細胞周期，實驗組G2/M期細胞百分比為20.3±2.1，高于陰性對照組（13.2±1.4），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），陰性對照組與空白對照組（14.5±0.6）比較無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。凋亡檢測顯示，實驗組凋亡細胞數(shù)百分比為6.33±1.21，低于陰性對照組（10.50±2.88），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），陰性對照組與空白對照組（1

6、0.17±3.13）無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。 （5）在劃痕實驗中，實驗組細胞劃痕距離明顯縮短，與陰性對照及空白對照組相比，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 （6）侵襲實驗顯示，穿膜細胞數(shù)實驗組為47.00±15.90個，明顯高于陰性對照組（26.88±12.99個）及空白對照組（28.90±12.94個），差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 （7）靶向誘導的CTL細胞對實驗組細胞殺傷率明顯低于陰性對照組（20