共刺激分子B7-H1在膀胱癌免疫逃逸和免疫治療中的作用研究.pdf

1、在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，腫瘤細胞和機體的免疫系統(tǒng)相互影響，相互制約。腫瘤細胞可以通過多種途徑逃避機體的免疫監(jiān)視作用而使自身得以繁衍和發(fā)展，即發(fā)生腫瘤的免疫逃逸現(xiàn)象。對腫瘤免疫逃逸機制的研究一直是攻克腫瘤道路上的一個熱點和難點。
　　 T細胞介導(dǎo)的細胞免疫是機體抗腫瘤免疫的主要形式之一，腫瘤免疫應(yīng)答的產(chǎn)生需要免疫系統(tǒng)有效識別和提呈腫瘤抗原，并活化特異性T細胞從而產(chǎn)生免疫殺傷作用。而腫瘤細胞往往可以通過異常表達和（或）缺如某些免疫分

2、子，使特異性T細胞處于無反應(yīng)或免疫耐受狀態(tài)，甚至導(dǎo)致T細胞凋亡，從而逃避機體的免疫殺傷作用。B7-H1是一種最近新發(fā)現(xiàn)的抑制性共刺激分子，其與受體結(jié)合后可以提供抑制性信號從而誘導(dǎo)T細胞凋亡，抑制T細胞的活化和增殖，是近年來發(fā)現(xiàn)與腫瘤免疫逃逸有關(guān)的重要分子之一。目前研究已發(fā)現(xiàn)B7-H1在人肺癌、卵巢癌、結(jié)腸直腸癌、黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、腎細胞癌等多種腫瘤組織表面都有大量表達，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。
　

3、　 膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其治療后的高復(fù)發(fā)率及其惡性進展的生物學(xué)行為均提示在膀胱癌中還存在著某些機制使膀胱癌細胞能夠逃避機體免疫細胞的殺傷作用，逃避機體的抗腫瘤免疫而繼續(xù)生長。B7-H1因其在T細胞活化和腫瘤免疫逃逸中的重要作用，已成為目前國內(nèi)外腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域的焦點之一。但是B7-H1在膀胱癌中的表達情況如何，特別是B7-H1是否在膀胱癌免疫逃逸機制中發(fā)揮作用，以及干預(yù)B7-H1信號能否成為膀胱癌免疫治療的新策略，目前

4、國內(nèi)外研究較少，鮮有報道。
　　 因此，本研究旨在通過檢測B7-H1在膀胱癌中的表達情況，并在體外檢測B7-H1過表達對腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxicity lymphocyte，CTL）抗膀胱癌免疫效應(yīng)的影響，進而探討其在膀胱癌免疫逃逸中的作用。在此基礎(chǔ)上，通過B7-H1阻斷型抗體阻斷B7-H1的表達，檢測B7-H1阻斷對腫瘤特異性CTL及兩種新型過繼免疫細胞（CD3AK細胞和CD3/CD28共刺激活化T細胞

5、）抗膀胱癌免疫效應(yīng)的影響，進而探討B(tài)7-H1阻斷在膀胱癌免疫治療中的作用，以期為膀胱癌的免疫治療提供新的策略。
　　 第一部分：膀胱癌組織中B7-H1的表達及其臨床意義
　　 目的：檢測B7-H1 mRNA及蛋白在膀胱癌組織中的表達情況，并探討B(tài)7-H1的表達與膀胱癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其臨床意義。
　　 方法：采用RT-PCR方法檢測B7-H1基因mRNA在膀胱癌組織中的表達情況，采用免疫組化法檢測B7-H1蛋白及

6、FasL蛋白在膀胱癌組織中的表達情況，并分析B7-H1的表達與膀胱癌各生物學(xué)指標及FasL表達的相關(guān)性，同時隨訪膀胱癌患者術(shù)后生存情況，將B7-H1的表達與患者術(shù)后生存時間進行生存分析。
　　 結(jié)果：B7-H1 mRNA和蛋白在正常膀胱組織中均無表達，而在膀胱癌組織中表達明顯增加，并且B7-H1的表達水平與膀胱癌的病理分級、臨床分期等生物學(xué)指標密切相關(guān)。高分級組及浸潤型組B7-H1 mRNA和蛋白的表達水平分別明顯高于低分級組和

7、淺表型組，復(fù)發(fā)組B7-H1蛋白的表達水平明顯高于初發(fā)組。同時，膀胱癌組織中B7-H1蛋白的表達與FasL蛋白的表達顯著相關(guān)。另外，B7-H1蛋白的表達與膀胱癌患者的預(yù)后具有明顯相關(guān)性，B7-H1陽性表達的患者其術(shù)后生存率明顯低于B7-H1陰性表達的患者，相關(guān)因素多變量分析發(fā)現(xiàn)B7-H1蛋白的表達可以作為膀胱癌的獨立預(yù)后指標之一。
　　 結(jié)論：B7-H1在膀胱癌中存在著過表達，并且其表達與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，可以作為評

8、價膀胱癌生物學(xué)行為的參考指標。B7-H1與其受體結(jié)合后可能通過上調(diào)FasL的表達，觸發(fā)特異性T細胞發(fā)生凋亡，從而介導(dǎo)膀胱癌細胞逃避機體的免疫監(jiān)視作用。
　　 第二部分：膀胱癌細胞系BIU-87中B7-H1的表達及LPS對其表達的誘導(dǎo)作用
　　 目的：檢測B7-H1在膀胱癌細胞系BIU-87中的表達情況以及LPS對其表達的誘導(dǎo)作用，同時通過LPS誘導(dǎo)形成高表達B7-H1的BIU-87細胞，從而為下一步實驗研究做準備。

9、>　　 方法：采用RT-PCR方法和Western blot方法分別檢測B7-H1 mRNA和蛋白在BIU-87細胞中的表達情況，隨即給予不同濃度的LPS進行誘導(dǎo)，進而采用RT-PCR方法和Western blot方法分別檢測誘導(dǎo)后B7-H1 mRNA和蛋白的表達情況。
　　 結(jié)果：體外常規(guī)培養(yǎng)未經(jīng)誘導(dǎo)的BIU-87細胞上有B7-H1 mRNA和蛋白的組成性表達，但表達量均較低。經(jīng)不同濃度LPS（0.5-2μg/mL）體外誘導(dǎo)

10、后，BIU-87細胞上B7-H1 mRNA和蛋白的表達量顯著增加，并且隨著LPS濃度的增加，B7-H1 mRNA和蛋白的表達量亦呈升高趨勢，其中當LPS濃度為1μg/mL時，B7-H1 mRNA和蛋白的表達量到達高峰。
　　 結(jié)論：膀胱癌BIU-87細胞上有B7-H1 mRNA和蛋白的組成性表達，但表達量較低，經(jīng)LPS誘導(dǎo)后B7-H1 mRNA和蛋白的表達均顯著增加。這表明可以通過LPS誘導(dǎo)形成高表達B7-H1的BIU-87細胞

11、，進而模擬體內(nèi)B7-H1高表達的膀胱癌局部微環(huán)境。
　　 第三部分：B7-H1 參與膀胱癌細胞免疫逃逸的體外實驗研究及其干預(yù)性治療
　　 目的：探討B(tài)7-H1在膀胱癌細胞免疫逃逸中的作用以及干預(yù)B7-H1信號對腫瘤抗原特異性CTL抗膀胱癌免疫效應(yīng)的影響。
　　 方法：利用LPS體外誘導(dǎo)形成高表達B7-H1的膀胱癌BIU-87細胞，以模擬膀胱癌患者體內(nèi)高表達B7-H1的腫瘤微環(huán)境。分離健康人外周血T細胞，以絲裂霉素

12、滅活的BIU-87細胞為刺激細胞，激活形成腫瘤抗原特異性CTL。將高表達B7-H1的BIU-87細胞及對照組BIU-87細胞與腫瘤抗原特異性CTL混合培養(yǎng)，MTT法檢測腫瘤抗原特異性CTL對BIU-87細胞的殺傷活性，PI染色流式細胞術(shù)檢測腫瘤抗原特異性CTL自身的凋亡率。然后利用B7-H1單克隆抗體阻斷BIU-87細胞表面B7-H1的表達，MTT法和流式細胞術(shù)分別檢測其對腫瘤抗原特異性CTL抗膀胱癌活性和自身凋亡率的影響。
　　

13、 結(jié)果：腫瘤抗原特異性CTL對高表達B7-H1的BIU-87細胞的殺傷活性與對照組相比明顯降低，而其自身的凋亡率卻明顯增加，體外存活時間亦明顯縮短。B7-H1表達被阻斷后，腫瘤抗原特異性CTL對BIU-87細胞的殺傷活性明顯增強，其自身凋亡率亦明顯降低，并且呈劑量依賴性。
　　 結(jié)論：膀胱癌細胞可以通過表達B7-H1誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL凋亡從而逃避腫瘤特異性CTL的殺傷作用，B7-H1可能在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展及免疫逃逸機制中發(fā)揮

14、重要的作用，干預(yù)B7-H1信號將有望成為膀胱癌免疫治療的新策略。
　　 第四部分：B7-H1 阻斷對CD3AK細胞及CD3/CD28 共刺激活化T細胞體外抗膀胱癌作用的影響
　　 目的：探討B(tài)7-H1阻斷對CD3AK細胞及CD3/CD28共刺激活化T細胞體外抗膀胱癌作用的影響。
　　 方法：分別利用CD3 mAb和CD3聯(lián)合CD28 mAb刺激健康人外周血淋巴細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生CD3AK細胞及CD3/CD28共刺激活化

15、T細胞。然后于培養(yǎng)體系中加入B7-H1阻斷型抗體阻斷B7-H1通路，3H-TdR滲入法檢測兩種免疫效應(yīng)細胞的體外增殖能力，ELISA法檢測其分泌IFN-γ、TNF-α和IL-10的水平。最后，將兩種免疫效應(yīng)細胞分別作用于膀胱癌BIU-87細胞，MTT法檢測其對BIU-87細胞的體外殺傷活性。
　　 結(jié)果：B7-H1被阻斷后，CD3AK細胞及CD3/CD28共刺激活化T細胞的體外增殖能力明顯增強，存活時間明顯延長；并且其分泌IFN