天府肉羊TNNT1、TNNT2和TNNI2基因的克隆以及組織表達(dá).pdf_第1頁
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文檔簡介

1、骨骼肌占產(chǎn)肉動物軀體的40%,是動物軀體中最重要的組成部分,也是影響肌肉品質(zhì)的重要因素之一,因而影響肉質(zhì)生產(chǎn)的骨骼肌基因是家畜分子育種工作中重要的候選基因。肌鈣蛋白I2型(TNNI2)基因和肌鈣蛋白T1(TNNT1)作為快骨骼肌基因,在動物骨骼肌生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用,是影響動物屠宰性能的重要功能基因;肌鈣蛋白T2(TNNT2)作為心肌亞型在影響心肌組織的正常活動方面具有很大的研究價值。
  本研究運用RT-PCR結(jié)合克

2、隆測序方法分別獲得了天府肉羊TNNT1、TNNI2和TNNT2基因的全編碼區(qū)序列。結(jié)果顯示:TNNT1基因CDS區(qū)長度是759 bp,編碼252個氨基酸,得到的蛋白序列含有一個保守結(jié)構(gòu)域,7個磷酸化位點,且該蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)只具有α-螺旋和無規(guī)則卷曲,沒有延伸片段,提交NCBI獲得登錄號:KF939315;TNNT2基因具有較長的CDS區(qū)858 bp,編碼285個氨基酸,蛋白序列含有15個磷酸化位點和一個保守結(jié)構(gòu)域,蛋白二級結(jié)構(gòu)主要為無

3、規(guī)則卷曲和α-螺旋,提交NCBI得到登錄號KF939316;克隆出天府肉羊的TNNI2基因,在NBCI數(shù)據(jù)庫中blast,發(fā)現(xiàn)CDS區(qū)長度為549 bp,編碼187個氨基酸。得到的該蛋白序列有1個保守結(jié)構(gòu)域,存在6個磷酸化位點,蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主,序列提交NCBI獲得登錄號:KF939314。
  對天府肉羊TNNT1氨基酸序列進(jìn)行比對,結(jié)果顯示天府肉羊與牛屬、人屬、海豚屬、綿羊?qū)佟⒉亓鐚?、八齒鼠屬、大熊貓屬

4、、豬屬、羊駝屬和貓屬的相似性則分別為94%、92%、93%、72%、85%、91%、92%、93%、93%和91%,在TNNTI基因與其他物種的進(jìn)化關(guān)系中,天府肉羊TNNT1基因與豬的關(guān)系最近,其次為綿羊、藏羚羊、八齒鼠和牛,家貓、雪貂和大熊貓分在一支,靈長類聚為一支;TNNT2氨基酸序列進(jìn)行比對,結(jié)果顯示天府肉羊與牛屬、人屬、水牛屬、長臂猿屬、犀牛屬、犬屬、熊貓屬、豬屬、雪貂屬和貓屬的相似性分別為94%、88%、95%、88%、89%

5、、89%、89%、91%、88%和89%;在進(jìn)化關(guān)系中天府肉羊TNNT2基因與反芻動物牛的關(guān)系最近,與人、黑猩猩和長臂猿等靈長類動物聚為一支,然后與雪貂和熊貓聚為一支,豬和小須鯨聚為一支,狼和海象聚為一支;TNNI2氨基酸序列與海象、豬、大鼠、家兔、小鼠、人、荷蘭豬、牛、黑猩猩和海豚的相似性分別為97%、96%、96%、95%、94%、96%、94%、98%、92%和92%,構(gòu)建TNNI2氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹中,天府肉羊與牛的親緣關(guān)系

6、最近,其次為海象、人、豬與海豚的最遠(yuǎn)。
  實時熒光定量RT-PCR技術(shù)測定天府肉羊的TNNT1、TNNT2和TNNI2基因在11個組織中的相對表達(dá)量,結(jié)果表明:TNNT1基因在肺臟中表達(dá)量最高,在心臟中表達(dá)量最低;在4個年齡階段中,365日齡肺臟中的表達(dá)量高于其他年齡段。TNNT2基因在心臟中高表達(dá),其次為肝臟和肺臟,其他8個組織之間差異不顯著;在心臟中,TNNT2基因表達(dá)量隨日齡的增長而增加。TNNI2基因在被檢測的11個組織

7、中,以腹肌中的表達(dá)量最高,其次為膈肌,在內(nèi)臟組織中表達(dá)量最低,檢測的肌肉組織中的相對表達(dá)量與內(nèi)臟組織的差異極顯著(P<0.01);在1日齡、183日齡、365日齡和730日齡腹肌組織中,365日齡與其他日齡間的差異極顯著(P<0.01)。
  蛋白質(zhì)免疫印跡(Westren Bloting)分析TNNT1蛋白在天府肉羊365日齡齡時8個組織中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,在8個組織中都檢測到信號,其中除膈肌信號弱外,其他都比較強;在表達(dá)量

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