蝎毒素BmK IA調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化增殖的研究.pdf

1、背景及目的：近年來(lái)興起的對(duì)蝎毒(Scorpion Venom)的研究是由于全蝎(scomion)作為我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥的動(dòng)物性藥材已有很久歷史。在《本草綱目》、《本經(jīng)逢源》、《開(kāi)寶本草》等經(jīng)典醫(yī)學(xué)叢書中都有對(duì)全蝎的記載。全蝎是一種傳統(tǒng)的中藥材，其性辛、平，味咸，有毒，歸肝經(jīng)；具有熄風(fēng)止痙、攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛的功效；傳統(tǒng)驗(yàn)方中主要用于治療小兒驚風(fēng)、抽搐痙攣、中風(fēng)、半身不遂、破傷風(fēng)、風(fēng)濕頑痹、瘡瘍、瘰疬和癲癇。另外，祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為腫瘤的根源是邪毒

2、瘀結(jié)、毒陷邪深，非攻不克，全蝎有攻堅(jiān)蝕瘡、破瘀散結(jié)、消除腫塊的功效，因此也常用于惡性腫瘤的治療，且有很多現(xiàn)代研究證明全蝎可以殺傷腫瘤細(xì)胞提高肌體免疫力。古代也有蝎尾藥力尤甚的記載。 現(xiàn)代研究認(rèn)為，蝎毒是一種成分復(fù)雜的混合物，由蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)兩部分組成，其含有多種生物活性成分，其中研究最多的且已被證明有諸多生理活性的主要是其蛋白質(zhì)部分的蝎毒素，一般含30～70個(gè)氨基酸殘基及3～4對(duì)二硫鍵，分子量為7000左右。研究表明蝎毒素中存

3、在很多的活性成分，對(duì)東亞鉗蝎(ButhusMartensii Karsch)毒素的研究結(jié)果顯示，其粗毒除含有特異作用于Na<'+>通道及Ca<'+>通道的主要配體，還含有特異作用于K<'+>通道的配體。蝎毒素所具有的機(jī)體治療作用已經(jīng)被很多研究證實(shí)，臨床研究顯示蝎毒可用于抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、降血壓、抗驚厥、以及某些神經(jīng)性疾病的治療，且部分文獻(xiàn)資料研究顯示蝎毒素在起治療作用的同時(shí)可以提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)骨髓造血功能，減少其它使用藥物的副作用。我們

4、課題組通過(guò)凝膠過(guò)濾層析法(Gel-filtration Chromatography)分離提取了東亞鉗蝎蝎毒成分BmK IA(Buthus martensii Karsch Immunol Action)，并且通過(guò)離子交換葡聚糖凝膠柱層析法(Ion exchange Sephadex column Chromatography)從BmK IA中進(jìn)一步分離得到五種純化蛋白成分蝎毒素BmK IA<,1>、BmK IA<,2>、BmK IA<

5、,3>、BmK IAt、BmK IA<,5>。本課題旨在通過(guò)細(xì)胞學(xué)的研究，探討蝎毒素體外調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，促使免疫細(xì)胞活化增殖的劑量效應(yīng)關(guān)系。通過(guò)流式細(xì)胞儀(Flow Cytometry)檢測(cè)比較T細(xì)胞被作用前后兩組細(xì)胞亞群膜表面分子CD69的表達(dá)變化來(lái)進(jìn)一步探討蝎毒素BmK IA調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化增殖可能作用途徑，以及某些潛在的免疫特性。 方法：人類急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株JurkatE6-1用含10％FBS(Fetal Bovin

6、eserum)的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。采用MTT法觀察不同濃度梯度的蝎毒素BmKIA及五種純化成分蝎毒素BmK IA<,1>、BmK IA<,2>、BmK IA<,3>、BmK IA<,4>、BmK IA<,5>對(duì)JurkatE6-1細(xì)胞增殖作用的劑量效應(yīng)關(guān)系；采用流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry Method，F(xiàn)CM)檢測(cè)蝎毒素BmK IA對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群CD4<'+>T細(xì)胞和CD8<'+>T細(xì)胞的膜表面活化表型分

7、子CD69表達(dá)情況。結(jié)果：(1)蝎毒素BmK IA對(duì)JurkatE6-1細(xì)胞的增殖作用隨濃度的遞增和細(xì)胞增殖率之間存在著一定的依賴關(guān)系；隨著蝎毒素BmK IA的工作濃度遞增JurkatE6-1的細(xì)胞增殖率達(dá)到90％，接著隨著蝎毒素BmK IA濃度的升高細(xì)胞增殖率開(kāi)始逐漸下降。而JurkatE6-1細(xì)胞的增殖程度和五種純化成分間均具有明顯的濃度正相關(guān)關(guān)系，均具有隨著濃度的加大細(xì)胞增殖率逐漸增高。(2)蝎毒素BmK IA對(duì)促使人外周血中CD

8、4<'+>T細(xì)胞中代表細(xì)胞活化的膜表面活化標(biāo)志CD69分子的表達(dá)在12小時(shí)達(dá)到高峰24％，24小時(shí)已有下降。對(duì)CD8<'+>T細(xì)胞中代表細(xì)胞活化的膜表面分子CD69的表達(dá)在24小時(shí)可以達(dá)到95％。 結(jié)論：蝎毒素BmK IA對(duì)研究T淋巴細(xì)胞活化模型一人類急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株JurkatE6-1有較強(qiáng)的增殖作用，該增殖作用和濃度之間有著一定的量效關(guān)系。從蝎毒素BmK IA中進(jìn)一步純化的五種成分蝎毒素BmK IA。、BmK IA

9、<,2>、BmK IA<,3>、BmK IA<,4>、BmK IA<,5>各自對(duì)JurkatE6-1細(xì)胞的促增殖作用程度均低于蝎毒素BmK IA，五種成分的作用和對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，且蝎毒素BmK IA在微量的工作濃度下就可以在12-24小時(shí)的時(shí)間內(nèi)促使人外周血中T細(xì)胞亞群的活化程度達(dá)到高峰，并且促使CD8<'+>T細(xì)胞活化的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于活化CD4<'+>T細(xì)胞?？偠灾舅谺mK IA可以促進(jìn)T細(xì)胞的活化增殖，且在