豬苓活性成分通過調節(jié)HuR介導T24細胞增殖抑制和凋亡.pdf

1、目的：
　　豬苓是藥用真菌，具有增強免疫、抗腫瘤功能等作用，臨床應用于膀胱癌的治療取得了較好療效，但其作用機制尚未完全闡明。豬苓的主要化學成分是多糖和甾體類，另外還有蛋白質、生物素等。本實驗主要研究豬苓活性成分通過調節(jié)HuR介導膀胱癌T24細胞增殖抑制和凋亡的機制。通過實驗達到如下目的:
　　1、研究HuR能否調控T24細胞BCL-2 mRNA轉錄后表達。
　　2、研究豬苓多糖能否通過HuR介導的轉錄后調節(jié)途徑調控T2

2、4細胞BCL-2基因的表達。
　　3、研究麥角甾醇能否通過HuR介導的轉錄后調節(jié)途徑調控T24細胞cyclin D1基因的表達。
　　方法：
　　1、研究HuR過表達對T24細胞BCL-2 mRNA轉錄后表達的調節(jié)
　　T24細胞用無抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后進行轉染實驗，實驗設空白對照組（未做任何處理）、陰性對照組（用陰性對照質粒轉染）、HuR質粒轉染組（用HuR質粒轉染）。用Western blotting

3、檢測各組HuR的表達，檢驗過表達的效果。
　　構建HuR過表模型，于過表達HuR后相應時間點用放線菌素D(Actinomycin D)終止RNA的合成，并于處理后的0h、2h、4h、6h四個時間點分別收集細胞提取RNA，以RT-PCR的方法檢測BCL-2mRNA的半衰期，研究HuR過表達對T24細胞BCL-2 mRNA穩(wěn)定性的影響。
　　構建HuR過表達模型，于過表達HuR后24h用RT-PCR測定BCL-2 mRNA表達，

4、用Western blotting檢測BCL-2蛋白的表達，分析HuR過表達后BCL-2 mRNA和蛋白表達量的變化。
　　2、研究HuR沉默對T24細胞BCL-2 mRNA轉錄后表達的調節(jié)
　　T24細胞用無抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后進行轉染實驗，用siHuR轉染T24細胞，實驗設空白對照組（未做任何處理）、陰性對照組（加入陰性對照siRNA）、siHuR處理組（加入針對HuR編碼區(qū)的siRNA）。轉染24h后，用Act

5、inomycin D終止RNA的合成，后按預定時間點檢測BCL-2mRNA的含量，并計算其半衰期，研究HuR沉默對T24細胞BCL-2mRNA穩(wěn)定性的影響。
　　構建構建HuR基因沉默模型，用RT-PCR測定HuR基因沉默對T24細胞BCL-2mRNA表達的影響，用Western blotting檢測HuR基因沉默對T24細胞BCL-2蛋白的表達的影響。
　　3、研究豬苓多糖(polyporus polysaccharide

6、，PPS)通過HuR介導的轉錄后調節(jié)途徑調控T24細胞BCL-2基因的表達
　　T24細胞常規(guī)培養(yǎng)后分4組，對照組（正常培養(yǎng)的細胞，未做任何處理）、PPS低劑量組（加入50μg/mL PPS）、PPS中劑量組（加入100μg/mL PPS）、PPS高劑量組（加入200μg/mL PPS）。
　　在進行細胞藥理實驗前，采用MTT法繪制細胞生長曲線，以掌握T24細胞的生長特性和確定合理的細胞接種密度，然后分別用Hoechst染色

7、、流式細胞分析技術檢測不同濃度PPS對T24細胞凋亡的影響。
　　研究PPS對T24細胞BCL-2基因表達的影響:用Western blotting和RT-PCR技術，分別檢測不同濃度PPS對T24細胞BCL-2蛋白和BCL-2 mRNA的影響。
　　研究PPS對T24細胞BCL-2 mRNA穩(wěn)定性的影響:用Actinomycin D阻抑轉錄，用RT-PCR測定各處理組細胞BCL-2 mRNA的相對表達量。分別以各組0h的m

8、RNA含量為100％，得到2、4、6h各時間點相對0h的mRNA剩余含量，檢測BCL-2mRNA的半衰期，以確定PPS對T24細胞BCL-2 mRNA穩(wěn)定性的影響。
　　研究PPS對HuR在T24細胞內定位的影響:各實驗組細胞經(jīng)不同濃度PPS處理24 h后，收集細胞，分段提取胞漿、胞核蛋白，Western blotting分析胞漿、胞核HuR蛋白的表達，以確定PPS對HuR在T24細胞內定位的影響。
　　研究PPS對T24細

9、胞內HuR-mRNA復合物中BCL-2 mRNA的含量:裂解細胞制備含mRNP的裂解液，預清除非特異性抗原，用抗體包被瓊脂糖徽球，免疫沉淀后進行沉淀產物mRNA的純化和目的基因的PCR擴增，以確定PPS對T24細胞內BCL-2 mRNA與HuR結合的影響。
　　4、麥角甾醇通過HuR介導的轉錄后調節(jié)途徑調控T24細胞cyclin D1基因的表達
　　T24細胞常規(guī)培養(yǎng)后分3組，實驗分3組，對照組（正常培養(yǎng)的細胞，未做任何處理

10、）、0.5μM麥角甾醇組、1μM麥角甾醇組。分別用MTT染色、流式細胞分析技術檢測麥角甾醇對T24細胞增殖的影響;用Western blotting和RT-PCR技術，分別檢測不同濃度麥角甾醇對T24細胞cyclin D1蛋白和cyclin D1mRNA的影響。
　　研究麥角甾醇對T24細胞cyclin D1 mRNA穩(wěn)定性的影響:用Actinomycin D阻抑轉錄，用RT-PCR測定各處理組細胞cyclin D1 mRNA的相

11、對表達量。分別以各組0h的mRNA含量為100％，得到2、4、6h各時間點相對0h的mRNA剩余含量，檢測cyclin D1 mRNA的半衰期，以確定麥角甾醇對T24細胞cyclin D1 mRNA穩(wěn)定性的影響。
　　研究麥角甾醇對HuR在T24細胞內定位的影響:各實驗組細胞經(jīng)不同濃度麥角甾醇處理48 h后，收集細胞，分段提取胞漿、胞核蛋白，Western blotting分析胞漿、胞核HuR蛋白的表達，以確定麥角甾醇對HuR在T