應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默RhoC基因調(diào)控炎性乳腺癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：炎性乳腺癌是原發(fā)性乳腺癌中惡性度最高的腫瘤，約占全部乳腺癌的1％～6％。IBC 亦是一種特殊的局部晚期乳腺癌，腫瘤細(xì)胞侵襲性和轉(zhuǎn)移性強(qiáng)，死亡率非常高。IBC組織學(xué)無明顯特異性，可表現(xiàn)為浸潤性導(dǎo)管癌、小葉細(xì)胞癌等，常見血管和淋巴管癌栓。IBC 腫瘤細(xì)胞呈低分化，并多伴局部淋巴結(jié)浸潤。由于IBC 惡性程度極高，病情發(fā)展迅速，早期即有全身廣泛轉(zhuǎn)移而危及生命，預(yù)后非常差。當(dāng)前臨床上主要采取以手術(shù)、放療、化療等綜合治療措施來處理這類疾病，但

2、是治療效果極其有限。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，癌基因RhoC在絕大多數(shù)炎性乳腺癌中廣泛表達(dá)，并且參與IBC的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)活動。這一發(fā)現(xiàn)為IBC的分子靶向治療提供了方向。本研究旨在探討利用RNA 干擾技術(shù)沉默IBCSUM190細(xì)胞株RhoC基因，分析其對IBC SUM190細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　 方法：收集66例乳腺良性疾病組織和94例乳腺癌組織，采用免疫組化方法，應(yīng)用彩色圖像灰度掃描分析系統(tǒng)檢測RhoC 蛋

3、白的表達(dá)，并分析其臨床意義。在體外實(shí)驗(yàn)中，人IBC SUM190細(xì)胞隨機(jī)分成對照組與實(shí)驗(yàn)組，對照組不加轉(zhuǎn)染試劑僅加細(xì)胞培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000和相關(guān)試劑正常轉(zhuǎn)染。以脂質(zhì)體介導(dǎo)的RhoC-siRNA 轉(zhuǎn)染人IBC SUM190細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染后48 小時(shí)，以半定量RT-PCR檢測人IBC SUM190細(xì)胞中RhoC mRNA的表達(dá)水平，以Western blot法測定人IBC SUM190細(xì)胞中RhoC 蛋白的表達(dá)水平。在轉(zhuǎn)染

4、后0、24、48、72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，以MTT 法檢測人IBC SUM190細(xì)胞生長情況。細(xì)胞生長速度以吸光度A 值表示。在轉(zhuǎn)染后48 小時(shí)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測人IBC SUM190細(xì)胞的凋亡情況。應(yīng)用transwell 小孔法檢測人IBC SUM190細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力的變化。在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，穿膜細(xì)胞數(shù)代表腫瘤細(xì)胞侵襲能力；在細(xì)胞轉(zhuǎn)移試驗(yàn)中，穿膜細(xì)胞數(shù)代表腫瘤轉(zhuǎn)移運(yùn)動能力。采用RT-PCR法檢測RhoC-siRNA 轉(zhuǎn)染人IBCSUM

5、190細(xì)胞后KAI1、MMP9、CXCR4 mRNA的表達(dá)。另外，采用免疫細(xì)胞化學(xué)法分析RhoC-siRNA 轉(zhuǎn)染后人IBC SUM190細(xì)胞中KAI1、MMP9、CXCR4 蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：RhoC 蛋白在乳腺良性疾病組織和乳腺癌組織中表達(dá)的平均灰度值分別為（0.051±0.014）、（0.328±0.122），二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RhoC 蛋白在年齡＜45歲和≥45歲乳腺癌中表達(dá)的平均灰度值分別為（0.3

6、07±0.111）、（0.358±0.172），二者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。無腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌中RhoC 蛋白表達(dá)的平均灰度值（0.266±0.107），有腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌中RhoC 蛋白表達(dá)的平均灰度值（0.409±0.187），二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌中RhoC表達(dá)的平均灰度值(0.237±0.088)，Ⅲ期乳腺癌中RhoC表達(dá)的平均灰度值（0.435±0.211），二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在體外實(shí)驗(yàn)中，以Rho

7、C-siRNA 轉(zhuǎn)染人IBC SUM190細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到70％。轉(zhuǎn)染后48 小時(shí)，對照組中人IBC SUM190細(xì)胞RhoC mRNA表達(dá)水平（0.907±0.387），實(shí)驗(yàn)組中人IBC SUM190細(xì)胞RhoC mRNA表達(dá)水平（0.367±0.152），二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對照組中人IBC SUM190細(xì)胞RhoC 蛋白表達(dá)水平（0.914±0.389），實(shí)驗(yàn)組中人IBC SUM190細(xì)胞RhoC 蛋白表達(dá)水平（0

8、.375±0.164），二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在轉(zhuǎn)染后0、24、48、72 小時(shí)各時(shí)間點(diǎn)，對照組人IBC SUM190細(xì)胞生長速度（吸光度A值）分別為（0.43±0.09）、（0.57±0.20）、（1.32±0.48)、（1.88±0.68)，實(shí)驗(yàn)組人IBC SUM190細(xì)胞生長速度（吸光度A 值）分別為（0.45±0.12）、（0.50±0.17）、（1.28±0.40）、（1.75±0.57），四個(gè)時(shí)相點(diǎn)二者之間的差異均無統(tǒng)計(jì)

9、學(xué)意義。對照組IBC SUM190細(xì)胞G0/G1 期細(xì)胞比例（52.26±3.68）％，實(shí)驗(yàn)組IBC SUM190細(xì)胞G0/G1 期細(xì)胞比例（55.38±3.85）％，二者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對照組IBC SUM190細(xì)胞S 期細(xì)胞比例（23.78±1.42）％，實(shí)驗(yàn)組IBC SUM190細(xì)胞S 期細(xì)胞比例（21.15±1.26）％，二者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對照組人IBC SUM190細(xì)胞凋亡率（4.77±0.34）％，實(shí)驗(yàn)組人IB

10、C SUM190細(xì)胞凋亡率（5.25±0.45）％，二者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，對照組人IBC SUM190細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)（352.2±50.6），實(shí)驗(yàn)組人IBC SUM190細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)（85.6±12.7），二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中，對照組人IBC SUM190細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)（189.6±23.3），實(shí)驗(yàn)組人IBC SUM190細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)（46.6±7.7），二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RhoC

11、-siRNA 轉(zhuǎn)染人IBC SUM190細(xì)胞48 小時(shí)后，對照組、實(shí)驗(yàn)組KAI1 mRNA表達(dá)水平分別為（0.462±0.192）、（0.762±0.281），二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對照組、實(shí)驗(yàn)組MMP9 mRNA表達(dá)水平分別為（0.889±0.349）、（0.587±0.212），二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對照組、實(shí)驗(yàn)組CXCR4 mRNA表達(dá)水平分別為（0.873±0.331）、（0.620±0.277），二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

12、義。KAI1 蛋白在對照組和實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)分別為(0.54±0.11)、(1.13±0.39)，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MMP9蛋白在對照組和實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)分別為(1.28±0.45)、(0.68±0.20)，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CXCR4 蛋白在對照組和實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)分別為（1.35±0.50）、（0.77±0.23），二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：RhoC 蛋白在原發(fā)性乳腺癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤病理特征密切