磷酸化p38MAPK在2型糖尿病大鼠大血管中的表達(dá)及阿托伐他汀的干預(yù)作用.pdf

1、目的:隨著人民生活水平的提高、生活方式的改變以及人口老齡化進(jìn)程的加速，我國糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)的患病率正在逐年增高，2007-2008年全國糖尿病患病率調(diào)查結(jié)果表明，我國20歲以上成人糖尿病患病率已達(dá)9.7％，據(jù)此推算，我國糖尿病總患病人數(shù)達(dá)9200萬以上，已成為世界第一糖尿病大國。糖尿病成為繼腫瘤、心血管疾病之后的第三大嚴(yán)重威脅人類健康的慢性非傳染性疾病。糖尿病的構(gòu)成以2型糖尿病(type2 diabet

2、es mellitus，T2DM)為主，占90％以上。糖尿病大血管病變是指主動脈、冠狀動脈、腦基底動脈、腎動脈及周圍動脈等發(fā)生病變，以動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）為主要病理基礎(chǔ)，它與單純的AS相比病變范圍大、程度重、發(fā)生早。大血管病變是危害最大的糖尿病慢性并發(fā)癥，是我國2型糖尿病患者主要的致殘、致死原因。約80％的2型糖尿病患者死于大血管并發(fā)癥，如心肌梗死、腦卒中等。研究顯示，AS的病理改變與絲裂素活化蛋白激酶(

3、mitogen-activated protein kinases，MAPK)的過度激活有關(guān)，p38 MAPK通路屬于MAPK家族，與內(nèi)皮細(xì)胞損傷關(guān)系密切，是參與炎癥反應(yīng)的重要的細(xì)胞內(nèi)通路，由此推測，磷酸化p38 MAPK參與了2型糖尿病大血管病變的發(fā)病過程。阿托伐他汀能夠有效降低血漿膽固醇(total cholesterol，TC)水平，減少低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）的生成，除調(diào)脂作用外，阿

4、托伐他汀還具有抗炎、改善血管內(nèi)皮功能、穩(wěn)定斑塊的作用。本課題通過高脂、高糖飼養(yǎng)wistar大鼠，建立具有2型糖尿病動脈粥樣硬化特點(diǎn)的動物模型，觀察wistar糖尿病大鼠胸主動脈磷酸化p38 MAPK表達(dá)水平的變化以及阿托伐他汀干預(yù)對磷酸化p38 MAPK表達(dá)水平的影響，探討p38 MAPK與糖尿病大血管動脈粥樣硬化的關(guān)系及阿托伐他汀的干預(yù)作用。
　　方法:選用4周齡健康雄性wistar大鼠25只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表將

5、大鼠隨機(jī)分為正常對照組(NC，n=6)和實(shí)驗(yàn)組(EX，n=19)，正常對照組采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)（20％的蔗糖、10％的熟豬油、2.5％的膽固醇、1％的膽酸、66.5％的標(biāo)準(zhǔn)飼料）。喂養(yǎng)4周后，實(shí)驗(yàn)組大鼠隔夜空腹腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，30 mg/kg），正常對照組僅注射等容積的檸檬酸緩沖液。于實(shí)驗(yàn)的第6周測大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，選擇

6、血糖≥7.8 mmol/L者為糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)（19只實(shí)驗(yàn)組大鼠中15只造模成功）。將成模糖尿病大鼠(n=15)隨機(jī)分為2組:2型糖尿病空白對照組(DM，n=7)、2型糖尿病+阿托伐他汀干預(yù)組(ATR，n=8)。阿托伐他汀組給予阿托伐他汀10 mg/kg灌胃，每日一次，正常對照組和糖尿病組給予等量的飲用水灌胃，共8周，實(shí)驗(yàn)過程中阿托伐他汀組1只大鼠死于灌胃。于實(shí)驗(yàn)第14周末空腹后分別測量大鼠體重、血糖，麻醉后心尖取血、分離血清，測定血清T

7、C、甘油三酯(triglyceride，TG)、LDL、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)、細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesionmolecule1，ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule1，VCAM-1)及核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor，NF)-κB水平;取胸主動脈縱切后觀察動

8、脈情況，取約1cm予以4％多聚甲醛固定，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察血管病理變化;免疫組織化學(xué)法測胸主動脈中磷酸化p38 MAPK、NF-κB、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractantprotein-1，MCP-1)的蛋白表達(dá)水平。以人工計(jì)數(shù)方法統(tǒng)計(jì)主動脈組織磷酸化p38 MAPK、NF-κB、MCP-1表達(dá)水平。采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)

9、準(zhǔn)差（(x)±s）表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)（最小值，最大值）表示，正態(tài)分布及方差齊的資料，用t檢驗(yàn)及單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，不符合正態(tài)檢驗(yàn)的資料，采用非參數(shù)檢驗(yàn)，指標(biāo)間的相關(guān)性檢驗(yàn)采用pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1各組大鼠一般情況
　　正常對照組大鼠狀態(tài)良好，飲食及尿量無明顯變化，體重呈逐漸增加趨勢。糖尿病組及阿托伐他汀組大鼠飲食、尿量有所增加，偶

10、有毛色發(fā)黃、晦暗，毛發(fā)散亂、潮濕、體重下降者，各組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(NC320.67±12.04 g;DM326.29±49.74 g;ATR317.43±48.67 g)。
　　2各組大鼠血清生化指標(biāo)結(jié)果
　　2.1實(shí)驗(yàn)6周末數(shù)據(jù)
　　正常對照組大鼠空腹血糖為6.50±0.52 mmol/L，實(shí)驗(yàn)組為15.90±4.85mmol/L，實(shí)驗(yàn)組大鼠空腹血糖較正常對照組明顯升高(P＜0.01)。
　　2.2實(shí)

11、驗(yàn)14周末，三組大鼠生化指標(biāo)
　　正常對照組:FBG6.33±0.69 mmol/L，TG0.81±0.27mmol/L，TC2.18±0.39 mmol/L,LDL1.24±0.47 mmol/L,HDL1.55±0.33mmol/L,ICAM-175.63±19.52 pg/ml,VCAM-1616.54±54.51 ng/ml,NF-κB78.68±12.15μmol/L。
　　糖尿病組:FBG12.99±2.07 m

12、mol/L，TG1.83±0.40 mmol/L，TC4.15±0.41 mmol/L, LDL2.53±0.44 mmol/L, HDL0.68±0.23 mmol/L,ICAM-1130.59±16.00 pg/ml, VCAM-1990.19±119.18 ng/ml, NF-κB170.22±21.53μmol/L。
　　阿托伐他汀組:FBG12.43±2.40 mmol/L，TG1.23±0.33 mmol/L，TC3.

13、07±0.51 mmol/L,LDL1.86±0.28 mmol/L,HDL0.98±0.33 mmol/L,ICAM-1102.61±15.15 pg/ml, VCAM-1809.29±150.27 ng/ml, NF-κB116.13±32.63μmol/L。
　　糖尿病組和阿托伐他汀組大鼠血糖較正常對照組明顯升高(P＜0.05)，糖尿病組和阿托伐他汀組大鼠血糖差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與正常對照組相比，糖尿病組大鼠血清TG、TC、L

14、DL、ICAM-1、VCAM-1、NF-κB顯著增高(P＜0.05)，經(jīng)阿托伐他汀干預(yù)治療8周后，阿托伐他汀組各項(xiàng)指標(biāo)較糖尿病組明顯降低(P＜0.05)，但仍高于正常對照組。糖尿病組及阿托伐他汀組HDL水平較正常對照組降低，阿托伐他汀組HDL水平較糖尿病組有所升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3胸主動脈病理改變
　　胸主動脈切片HE染色鏡下檢查:正常對照組可見血管內(nèi)皮細(xì)胞完整，排列整齊，內(nèi)膜光滑，中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊。

15、>　　糖尿病組可見主動脈內(nèi)皮細(xì)胞腫大變性，胞核皺縮，內(nèi)膜增厚，可見泡沫細(xì)胞聚集，內(nèi)彈力板斷裂，中膜平滑肌細(xì)胞排列紊亂，可見膠原纖維增生，外膜可見新生毛細(xì)血管
　　阿托伐他汀組可見血管內(nèi)皮細(xì)胞基本完整，內(nèi)膜偶有增厚，中膜平滑肌細(xì)胞排列基本整齊。
　　4免疫組化結(jié)果
　　和正常對照組相比，糖尿病組血管組織磷酸化p38 MAPK、NF-κB、MCP-1表達(dá)水平升高(P＜0.05)，阿托伐他汀干預(yù)治療8周后，阿托伐他汀組血管組

16、織磷酸化p38 MAPK、NF-κB、MCP-1表達(dá)水平較糖尿病組降低(P＜0.05)。pearson相關(guān)分析顯示主動脈磷酸化p38 MAPK蛋白和NF-κB(r=0.406，P=0.001)、MCP-1(r=0.310，P=0.016)蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1 p38 MAPK過度激活參與了糖尿病大血管病變的發(fā)生發(fā)展。
　　2阿托伐他汀通過調(diào)脂、降低磷酸化p38 MAPK的表達(dá)以及抗炎機(jī)制，在糖尿病