磷酸化p38MAPK在2型糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈中的表達(dá)及利拉魯肽的干預(yù)作用.pdf

1、目的:糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一組以慢性血漿葡萄糖水平增高為特征的代謝性疾病，其中，2型糖尿病(type2 diabetes mellitus，T2DM)占DM的90％以上。隨著人民生活水平的提高，我國(guó)T2DM的患病率逐年上升，因DM并發(fā)癥死亡的人數(shù)也逐年增多。在諸多并發(fā)癥中，大血管并發(fā)癥是T2DM患者的主要死亡原因，約80％的T2DM患者死于大血管疾病。動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是

2、T2DM大血管病變的主要病理特征，與單純的AS相比，T2DM患者的AS發(fā)生早、范圍大、程度重。研究顯示，AS的病理改變與絲裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)的過(guò)度激活有關(guān)。p38 MAPK通路屬于MAPK家族，與內(nèi)皮細(xì)胞損傷關(guān)系密切，是參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)通路。由此我們推測(cè)，磷酸化p38 MAPK參與了T2DM大血管病變的發(fā)病過(guò)程。利拉魯肽是一種GLP-1類似物。研究

3、顯示，利拉魯肽不僅具有降糖作用，而且可能具有改善血管內(nèi)皮功能和抗炎作用。本課題通過(guò)高脂、高糖飼料飼養(yǎng)wistar大鼠，建立具有T2DM動(dòng)脈粥樣硬化特點(diǎn)的動(dòng)物模型，觀察T2DM大鼠胸主動(dòng)脈磷酸化p38 MAPK蛋白表達(dá)水平的變化以及利拉魯肽干預(yù)治療對(duì)其表達(dá)的影響，探討p38 MAPK與T2DM動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系及利拉魯肽的干預(yù)作用。
　　方法:選用4周齡健康雄性wistar大鼠24只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表將大鼠隨機(jī)分為對(duì)

4、照組(NC，n=6)和實(shí)驗(yàn)組(EXP，n=18)，NC組采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，EXP組采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)（20％的蔗糖、10％的熟豬油、2.5％的膽固醇、1％的膽酸、66.5％的標(biāo)準(zhǔn)飼料）。喂養(yǎng)4周后，EXP組大鼠隔夜空腹腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）30mg/kg，NC組僅注射等容積的檸檬酸緩沖液。于實(shí)驗(yàn)的第6周測(cè)大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，選擇血糖≥7.8mmol/L

5、者為糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)（18只實(shí)驗(yàn)組大鼠中，14只造模成功）。將成模的14只EXP組大鼠隨機(jī)分為2組:2型糖尿病空白對(duì)照組(DM，n=7)、2型糖尿病+利拉魯肽干預(yù)組(LIR，n=7)。LIR組給予利拉魯肽100ug/kg皮下注射，每日2次，NC組和DM組給予等量的生理鹽水皮下注射，共8周。于實(shí)驗(yàn)第14周末分別測(cè)量各組大鼠體重，行腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(Intraperitoneal Glucose Tolerance Test，IPGTT)，

6、采用近似梯形面積的方法計(jì)算葡萄糖曲線下面積(Glucose Area under the curve，AUCg，mmol·L-1·h)和胰島素曲線下面積(Insulin Area under the curve，AUCINS，mIU·L-1·h)，并計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型-胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=FPG(mmol/L)×FINS(mIU/L)/22.5和穩(wěn)態(tài)模型-胰島β細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-β)=20×FINS(mlU/L)/[FPG

7、(mmol/L)-3.5]。處死動(dòng)物前，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后心尖取血、分離血清，測(cè)定FBG、血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein-cholesterol HDL-C)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular

8、adhesion molecule，ICAM-1)、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule，VCAM-1)和核因子-κB(nuclearfactor-kappa B，NF-κB)水平。取胸主動(dòng)脈，予以4％多聚甲醛固定，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察血管病理變化;免疫組織化學(xué)法測(cè)胸主動(dòng)脈中磷酸化p38 MAPK、NF-κB和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractantp

9、rotein-1，MCP-1)的蛋白表達(dá)水平。以人工計(jì)數(shù)方法統(tǒng)計(jì)大鼠主動(dòng)脈中磷酸化p38 MAPK、NF-κB、MCP-1的蛋白表達(dá)水平。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0軟件進(jìn)行，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、各組大鼠一般情況
　　NC組大鼠一般情況良好，體重逐漸增加。DM組大鼠多食、多飲、多尿癥狀明顯、體重有所增加，LIR組無(wú)明顯多食、多飲、多尿癥狀，體重有所增加。各組大鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

10、NC320.7±12.0g; DM326.3±69.6g; LIR316.3±34.2g)。
　　2、各組大鼠血清生化指標(biāo)結(jié)果
　　2.1實(shí)驗(yàn)6周末數(shù)據(jù)
　　NC組大鼠FBG為6.50±0.52mmol/L，EXP組為15.90±4.85mmol/L，EXP組FBG較NC組明顯升高(P＜0.05)(Table1，F(xiàn)ig.1)。
　　2.2實(shí)驗(yàn)14周末（即利拉魯肽干預(yù)8周末），三組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)
　　2.2.1

11、三組大鼠血糖水平
　　DM組FBG12.99±2.07 mmol/L, LIR組FBG8.87±1.82 mmol/L,均明顯高于NC組FBG6.33±0.69 mmol/L(P＜0.05);LIR組FBG較DM組明顯下降(P＜0.05);DM組和LIR組AUCg分別為[(34.34±7.63)mmol·L-1·h]和[(27.67±4.93) mmol·L-1·h]，均明顯高于NC組[(18.72±3.27)mmol·L-1·h

12、](P＜0.05)，LIR組AUCg較DM組明顯下降(P＜0.05)(Table2,Fig.2,3)
　　2.2.2三組大鼠胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)
　　DM組[(6.49±1.99)mIU/L]和LIR組[(11.13±1.92)mIU/L]空腹胰島素(Fasting insulin, FINS)明顯低于NC組[(18.02±2.52)mIU/L]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);LIR組FINS水平較DM組明顯升高

13、(P＜0.05);DM組[(27.40±10.32) mIU·L-1·h] AUCINS明顯低于NC組[(49.22±4.44)mIU·L-1·h]和LIR組[(40.42±6.71) mIU·L-1·h](P＜0.05)，但NC組和LIR組間AUCINS無(wú)明顯差異(P＞0.05）;三組間HOMA-IR無(wú)明顯差異(P＞0.05); DM組(14.04±3.87)和LIR組(45.95±20.65)的HOMA-β顯著低于NC組(132.4

14、4±30.30)(P＜0.05)，LIR組HOMA-β較DM組明顯升高(P＜0.05)(Table2, Fig.4-Fig.6)。
　　2.2.3三組大鼠血清生化指標(biāo)
　　NC組: TG0.80±0.26 mmol/L, TC2.18±0.39 mmol/L, LDL1.24±0.47mmol/L, HDL-C1.55±0.33 mmol/L, ICAM-175.63±7.97pg/ml, VCAM-1616.54±54.5

15、1 ng/ml, NF-κB78.68±12.15μmol/L
　　DM組:TG1.83±0.40 mmol/L, TC4.15±0.41 mmol/L, LDL2.53±0.44mmol/L, HDL-C0.68±0.23 mmol/L, ICAM-1130.59±16.00pg/ml, VCAM-1990.19±119.18 ng/ml, NF-κB170.22±21.53μmol/L
　　LIR組:TG1.20±0.3

16、0 mmol/L, TC3.42±0.82 mmol/L, LDL1.86±0.28mmol/L, HDL-C0.92±0.11 mmol/L, ICAM-197.81±7.62pg/ml, VCAM-1797.58±131.10ng/ml, NF-κB116.14±32.63μmol/L
　　DM組TG、TC、 LDL-C、ICAM-1、VCAM-1、NF-κB均明顯高于LIR組及NC組(P＜0.05)，LIR組上述指標(biāo)明顯高于

17、NC組（P＜0.05），DM組和LIR組大鼠HDL-C水平較NC組顯著降低(P＜0.05)，LIR組大鼠HDL-C水平較DM組有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(Table2,Fig.7-Fig.10)。
　　3、胸主動(dòng)脈病理改變
　　胸主動(dòng)脈切片HE染色:
　　NC組血管壁結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，內(nèi)膜完整光滑，內(nèi)膜、中膜、外膜及平滑肌細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰。
　　DM組可見(jiàn)主動(dòng)脈血管壁結(jié)構(gòu)不清晰、管壁厚度不均勻

18、，內(nèi)膜增厚，內(nèi)皮細(xì)胞腫大變性，內(nèi)彈力板斷裂，中膜平滑肌細(xì)胞排列紊亂，膠原纖維增生。
　　LIR組可見(jiàn)主動(dòng)脈慢性炎癥反應(yīng)較DM組大鼠明顯減輕，胸主動(dòng)脈血管壁無(wú)明顯隆起，內(nèi)膜下有少許炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但浸潤(rùn)程度下降，平滑肌細(xì)胞排列較整齊，血管內(nèi)皮細(xì)胞基本完整，內(nèi)膜偶有增厚。(Fig.11)4免疫組化結(jié)果:細(xì)胞漿和細(xì)胞膜為MCP-1陽(yáng)性部位，呈彌漫黃色或棕黃色顆粒。細(xì)胞核為磷酸化p38 MAPK、NF-κB陽(yáng)性部位。
　　NC組大鼠胸

19、主動(dòng)脈磷酸化p38 MAPK、NF-κB、MCP-1蛋白表達(dá)平均積分分別為1(0，4)，1.5(0，4)，2(0，3)。
　　DM組大鼠胸主動(dòng)脈磷酸化p38 MAPK、NF-κB、MCP-1蛋白表達(dá)平均積分分別為4(1，9)，4(1，12)，4(1，16)。
　　LIR組大鼠胸主動(dòng)脈磷酸化p38 MAPK、NF-κB、MCP-1蛋白表達(dá)平均積分分別為2(1，6)，3(1，4)，3(1，6)。
　　和NC組相比，DM組、

20、LIR組大鼠胸主動(dòng)脈中磷酸化p38 MAPK、NF-κB、MCP-1蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)，LIR組大鼠胸主動(dòng)脈中磷酸化p38 MAPK、NF-κB、MCP-1蛋白表達(dá)水平較DM組顯著降低(P＜0.05)。Spearman分析顯示，胸主動(dòng)脈磷酸化p38 MAPK蛋白和NF-κB、MCP-1蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.458、0.318，P＜0.05)。(Fig.12-Fig.14 and table4)
　　結(jié)論: