p38MAPK與2型糖尿病大鼠大血管病變的關(guān)系及二甲雙胍的干預(yù)作用.pdf

1、目的:2型糖尿病(type2 diabetes mellitus，T2DM)是一種多基因遺傳的代謝性疾病，約80％的T2DM患者死于大血管并發(fā)癥，如心肌梗死、腦卒中等，大血管病變是我國(guó)T2DM患者主要的致殘、致死原因，是危害最大的DM慢性并發(fā)癥。糖尿病大血管病變包括心、腦和周?chē)笱懿∽?，主要以?dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)為病理基礎(chǔ)，它與單純的AS相比病變范圍大、程度重、發(fā)生早。研究顯示，AS的病理改變與絲裂素活

2、化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)的過(guò)度激活有關(guān)，p38MAPK通路屬于MAPK家族，與內(nèi)皮細(xì)胞損傷關(guān)系密切，是參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)的重要通路，由此推測(cè)磷酸化p38MAPK參與了T2DM大血管病變的發(fā)病過(guò)程。二甲雙胍除能夠有效降低血糖，降低血漿胰島素水平及增加胰島素敏感性外，還有抗炎、抗氧化應(yīng)激、改善血管內(nèi)皮功能等作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高糖、高脂飲食聯(lián)合腹腔內(nèi)小劑量注射鏈脲佐菌素制備T2

3、DM大鼠模型，繼而采用二甲雙胍進(jìn)行干預(yù)治療，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢測(cè)各組大鼠胸主動(dòng)脈中磷酸化的p38MAPK蛋白表達(dá)水平變化，探討p38MAPK與糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系及二甲雙胍對(duì)T2DM動(dòng)脈粥樣硬化的影響及其機(jī)制。
　　方法:建立2型糖尿病大鼠模型:選用4周齡健康雄性Wistar大鼠25只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(NC，n=6)和實(shí)驗(yàn)組(EX，n=19)。NC組采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng); EX組采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)

4、（20％的蔗糖、10％的熟豬油、2.5％的膽固醇、1％的膽酸、66.5％的標(biāo)準(zhǔn)飼料）。喂養(yǎng)4周后，EX組大鼠隔夜空腹腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg，（用前以PH4.4的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液配成1％的濃度），對(duì)照組僅注射等容積的檸檬酸緩沖液。于實(shí)驗(yàn)的第6周即注射STZ2周后，選擇空腹血糖≥7.8 mmol/L者為糖尿病成模大鼠。19只EX大鼠中造模成功者15只，將成模糖尿病大鼠隨機(jī)分為2組:2型糖尿病空白對(duì)照組(D

5、M-C，n=7)、2型糖尿病+二甲雙胍干預(yù)組(DM-T，n=8)。DM-T組給予二甲雙胍200 mg/kg溶于大鼠飲用水中灌胃，每日一次，NC組和DM-C組給予等量的飲用水灌胃，每周稱(chēng)體重1次，共8周。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程共持續(xù)14周。于實(shí)驗(yàn)第14周末分別測(cè)量各組大鼠體重，行腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(IPGTT)，并計(jì)算葡萄糖曲線下面積(Glucose Area underthe curve，AUCg)，胰島素曲線下面積(Insulin Area u

6、nder the curve，AUCi)，胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR，HOMA-IR=FPG×FINS/22.5)和胰島β細(xì)胞功能指數(shù)[HOMA-β=20×FINS/(FPG-3.5)]。心尖取血并分離血清，測(cè)定膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)，ICAM-1，VCAM-1，NF-κB水平，取胸主動(dòng)脈進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察血管病理變化;免疫組化法測(cè)定胸主動(dòng)脈中磷酸化的p38MA

7、PK，NF-κB，MCP-1的蛋白表達(dá)水平。采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1實(shí)驗(yàn)6周末數(shù)據(jù)
　　對(duì)照組大鼠空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)BG)為6.50±0.52mmol/L，實(shí)驗(yàn)組FBG為16.56±5.20 mmol/L，實(shí)驗(yàn)組FBG水平較對(duì)照組明顯升高(P=0.003)(Ta

8、blel，F(xiàn)ig.1)。
　　2實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(14周末)，各組大鼠生化指標(biāo)
　　2.1三組大鼠血糖水平
　　糖尿病組FBG12.99±2.07 mmol/L，二甲雙胍組FBG9.03±1.49mmol/L，均明顯高于對(duì)照組FBG6.33±0.69 mmol/L(P＜0.05);二甲雙胍組FBG較糖尿病組明顯下降(P＜0.05);糖尿病組葡萄糖曲線下面積AUCg(34.34±7.63 mmol·L-1·h)，二甲雙胍組AU

9、Cg(32.38±6.65mmol·L-1·h)，均高于對(duì)照組AUCg(18.72±3.27 mmol·L-1·h)(P=0.001)，但糖尿病和二甲雙胍組間無(wú)明顯差異(P＞0.05)(Table2，F(xiàn)ig.2，3)。
　　2.2三組大鼠胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)、胰島素分泌指數(shù)間的比較
　　糖尿病組空腹胰島素(Fasting insulin，F(xiàn)INS)20.00±5.91 mIU/L，明顯高于對(duì)照組（11.34±3.88

10、mIU/L）和二甲雙胍組FINS水平(13.61±7.60mIU/L)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.049)，而對(duì)照組和二甲雙胍組間FINS水平無(wú)明顯差異;對(duì)照組胰島素曲線下面積AUCi(47.55±5.23 mIU·L-1·h)，明顯高于二甲雙胍組(32.78±11.64 mIU·L-1·h)和糖尿病組(30.78±11.25mIU·L-1·h)(P=0.006)，糖尿病和二甲雙胍組間AUCi無(wú)明顯差異(P＞0.05);糖尿病組HOM

11、A-IR（11.20±2.22）明顯高于對(duì)照組（3.13±0.88）和二甲雙胍組（5.67±3.73）(P＜0.05)，對(duì)照組和二甲雙胍組組間HOMA-IR無(wú)明顯差異（P＞0.05）;三組間HOMA-β無(wú)明顯差異（P＞0.05）（Table2，F(xiàn)ig.4，5，6）。
　　2.3三組大鼠血清生化指標(biāo)
　　對(duì)照組:TG0.81±0.27 mmol/L,TC2.18±0.39 mmol/L,LDL-C1.24±0.47 mmolL

12、，HDL1.55±0.33 mmol/L，ICAM-175.63±19.52 pg/ml, VCAM-1616.54±54.51 ng/ml, NF-κB78.68±12.15μmol/L
　　糖尿病組:TG1.83±0.40 mmol/L，TC4.15±0.41 mmol/L，LDL-C2.53±0.44 mmol/L，HDL0.68±0.23 mmol/L,ICAM-1130.59±16.00 pg/ml, VCAM-1990

13、.19±119.18 ng/ml, NF-κB170.22±21.53μmol/L
　　二甲雙胍組:TG1.33±0.30 mmol/L，TC3.21±0.46 mmol/L，LDL-C2.24±0.31 mmol/L, HDL-C0.98±0.34 mmol/L, ICAM-1102.86±15.76 pg/ml,VCAM-1860.66±112.72 ng/ml,NF-κB110.86±26.89μmol/L
　　結(jié)果顯

14、示，糖尿病組和二甲雙胍組大鼠TG, TC，LDL-C，ICAM-1，VCAM-1，NF-κB水平均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，二甲雙胍組TG、TC，ICAM-1，VCAM-1，NF-κB水平低于糖尿病組(P＜0.05)，二甲雙胍組LDL-C水平較糖尿病組稍有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與對(duì)照組相比，糖尿病組和二甲雙胍組HDL-C水平顯著降低(P＜0.05)，但糖尿病和二甲雙胍組組間HDL-C水平無(wú)明顯差異(P＞0.05

15、)(Table2-3，F(xiàn)ig.7-10)。
　　3胸主動(dòng)脈病理改變
　　胸主動(dòng)脈HE染色結(jié)果:血管組織切片HE染色后光鏡下檢查，對(duì)照組血管壁結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜光滑完整，平滑肌細(xì)胞排列整齊，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，中層及外膜結(jié)構(gòu)清楚，未見(jiàn)病理性改變;糖尿病組可見(jiàn)血管壁彌漫性隆起，突向管腔面，內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)膜下平滑肌細(xì)胞排列紊亂、增生，內(nèi)有脂質(zhì)沉積，形成大小不等、形態(tài)不規(guī)則的泡沫細(xì)胞，膠原纖維和彈性纖維增多;應(yīng)用二甲雙胍治療后，胸主動(dòng)脈

16、血管壁無(wú)明顯隆起，平滑肌細(xì)胞排列較整齊(Fig.11-13)。
　　4免疫組化結(jié)果:和對(duì)照組相比，糖尿病組和二甲雙胍組大鼠胸主動(dòng)脈中p-p38MAPK，NF-κB，MCP-1蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05);和糖尿病組相比，二甲雙胍組大鼠胸主動(dòng)脈中p-p38MAPK，NF-κB，MCP-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)(Table4，F(xiàn)ig.14-16)。
　　結(jié)論:
　　1磷酸化p38MAPK參與了糖尿病大